Marquage immunohistochimique Fluorescent multiplexé, l’imagerie et l’analyse des échantillons histologique du lymphome
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour multiplex immunohistochemical fluorescent de coloration et d’imagerie pour la localisation simultanée de plusieurs antigènes associés aux cancer des lymphomes. Ce protocole peut être étendu à l’analyse de colocalisation de biomarqueurs dans toutes les coupes de tissus.
Abstract
Immunohistochimie (IHC) méthodes pour l’analyse in situ d’expression de la protéine au microscope photonique sont un outil puissant pour la recherche et des fins de diagnostic. Cependant, la visualisation et la quantification des antigènes multiples dans une section de tissu unique aide IHC chromogène conventionnel est difficile. L’imagerie multiplexé est particulièrement pertinent dans la recherche de lymphome et de diagnostics, où les marqueurs devront être interprétées dans le contexte d’un micro-environnement tumoral complexe. Nous décrivons ici un protocole pour multiplexé IHC fluorescent coloration afin de permettre l’évaluation quantitative de cibles multiples dans les types spécifiques de cellules d’intérêt dans le lymphome. La méthode couvre les aspects de validation de l’anticorps, l’optimisation de l’anticorps, l’optimisation multiplexe avec des marqueurs des sous-types de lymphomes, la coloration des lames de tissu microarray (TMA) et la numérisation des diapositives, suivie d’analyse de données, avec spécifiques référence de lymphome. En utilisant cette méthode, partitions pour les deux l’intensité moyenne d’un marqueur d’intérêt et la pourcentage de positivité sont générées afin de faciliter la poursuite des analyses quantitatives. Multiplexage minimise l’utilisation de l’échantillon et fournit de l’information spatiale pour chaque marqueur d’intérêt.
Introduction
Les tumeurs lymphoïdes sont causés par la prolifération maligne anarchique des lymphocytes. Ces cellules sont des composantes essentielles du système immunitaire et localiser les organes immunitaires primaires et secondaires, tels que la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, la rate et autre système lymphoïde associé aux muqueuses. Les tumeurs lymphoïdes sont un groupe hétérogène d’affections qui sont classées basé sur une constellation de caractéristiques, dont la morphologie lymphoblastiques, les caractéristiques génétiques et présentation clinique. Tandis que chaque paramètre joue un rôle, lignée reste une caractéristique déterminante et constitue la base pour le système de classification OMS qui reconnaît les néoplasmes dérivés de cellules B et les lymphocytes T natural killer (NK) cellules1.
Clé à la classification du lymphome est la caractérisation des anticorps contre les marqueurs de surface de leucocytes des différents sous-types de lymphocytes2. L’immunohistochimie (IHC) a été utilisé traditionnellement pour l’analyse de ces marqueurs et repose sur le principe de la reconnaissance de l’antigène-anticorps spécifique pour détecter des molécules axée sur les cellules et les tissus qui peuvent être visualisées par le microscope photonique 3. Toutefois, l’identification de cibles multiples sur une seule diapositive, par conventionnel lumineux-zone chromogène multiplex IHC a des limites car il est souvent difficile de distinguer de multiples signaux de couleur sur une section de tissu unique fiable — surtout pour les antigènes avec une expression très faible4. Évaluation visuelle et la quantification de coloration peuvent aussi être subjectives, provoquant la variabilité dans l’analyse et les données interprétation5.
IHC classique sur des échantillons (FFIP) fixés au formol, paraffine n’est donc pas possible pour la détection simultanée de multiples cibles immunologiquement diverses maladies comme le lymphome. En outre, la distinction lymphocytes néoplasiques des cellules immunitaires environnantes est souvent imprécise. Cela empêche les études examinant la pertinence de nouveaux biomarqueurs dans le lymphome. Dans ce contexte, multiplexe fluorescent IHC (mf-IHC) offre une alternative prometteuse, car il permet l’évaluation quantitative de la coexpression de l’antigène et une relation spatiale avec une plus grande précision tout en conservant un limité d’échantillons6,7. Lorsque cette technologie d’imagerie est en partenariat avec le logiciel d’analyse de l’image numérique, l’interprétation des données est rendue plus efficace et facilite l’étude de la tumeur et microenvironnement hétérogénéité8,9. Dans ce protocole, une base tyramide immunofluorescence (IF) méthode de multiplexage est appliquée pour amplifier le signal et est compatible avec n’importe quel anticorps IHC-validé de toute espèce d’hôte, même ceux mis au point à la même espèce5,7 , 10. le protocole tyramide permet la conjugaison directe du fluorophore au tissu d’intérêt pour que les anticorps primaires et secondaires peuvent être dépouillés après chaque étape, permettant l’application séquentielle de plusieurs taches sans la réactivité des anticorps.
Une stratégie multiplexée sera utile pour prédire le pronostic et le traitement des résultats par l’identification des cibles et leurs profils immunologiques variant dans les lymphomes. Multiplexe fluorescent IHC a été appliquée dans notre laboratoire pour l’étude d’un panel de marqueurs T et les lymphocytes B et T-folliculaire d’assistance dans le lymphome de T-cellule d’angioimmunoblastic (AITL), un sous-type d’un lymphome à cellules T périphérique caractérisée par agressivité clinique comportement et tumeur hétérogénéité11. L’utilité de cette méthode est également illustrée en diffus grand lymphome B (LMNH) où la signalisation accrue d’un récepteur des cellules B avec l’expression simultanée de C-MYC et BCL-2 suggère l’utilisation thérapeutique potentielle d’inhibition de la tyrosine kinase de Bruton 12 .
Nous décrivons ici l’ensemble du protocole de validation de l’anticorps à la sélection des tissus appropriés de contrôle et de multiplexage à l’aide de lymphome FFIP tissus, avec une éventuelle analyse de lames colorées en utilisant un balayage automatisé d’imagerie quantitative pathologie système.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC a le potentiel pour permettre des pathologistes d’affiner diagnosticcriteria en pathologie lymphoïde et d’analyser le rôle des biomarqueurs dans les types spécifiques de cellules vers une prévision des résultats cliniques. Comme une nouvelle méthode de recherche, mf-IHC est plus appliquée à la détermination quantitative et spatiale des multiples paramètres immunitaires des cellules de tumeur17. La détection de mf-IHC pour la co-expression de biomarqueurs de la tumeur s’est …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. et A.D.J. sont pris en charge par nationale médicale recherche Conseil Transition Awards le Singapour ministère de la santé (NMRC/TA/0020/2013 et NMRC/TA/0052/2016). Les auteurs reconnaissent une subvention de recherche de Yoon Yong Siew à A.D.J. de l’Université nationale du Cancer Institut de Singapour pour l’achat d’un microscope d’imagerie spectral de Vectra. Cette étude est approuvée par le Singapore NHG domaine spécifique Review Board B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
