Multiplex fluorescerende immunhistokemisk farvning, billedbehandling og analyse i histologiske prøver af lymfom
Summary
Her beskriver vi en protokol for multiplex fluorescerende immunhistokemisk farvning og imaging for simultan lokalisering af flere kræft-associerede antigener i lymfom. Denne protokol kan udvides til en colocalization analyse af biomarkører inden for alle væv sektioner.
Abstract
Immunhistokemiske (IHC) metoder til in situ analyse af protein udtryk ved lysmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til både forskning og diagnostiske formål. Men, visualisering og kvantificering af flere antigener i en enkelt væv afsnit ved hjælp af konventionelle kromogent IHC er udfordrende. Multiplex imaging er især relevant i lymfom forskning og diagnosticering, hvor markører skal fortolkes i forbindelse med en kompleks tumor mikromiljø. Her beskriver vi en protokol for multipleksede fluorescerende IHC farvning for at aktivere den kvantitative vurdering af flere mål i specifikke celletyper interesse for lymfom. Metoden dækker aspekter af antistof validering, antistof optimering, multiplex optimering med markører af lymfom undertyper, farvning af væv microarray (TMA) dias, og scanning af dias, efterfulgt af dataanalyse med specifikke henvisning til lymfom. Brug denne metode, genereres noder for begge betyde intensiteten af en markør for interesse og procentdel positivitet for at lette yderligere kvantitative analyser. Multiplexing minimerer prøve udnyttelse og giver geografisk information for hver markør af interesse.
Introduction
Lymfoide neoplasmer er forårsaget af ukontrolleret maligne spredning af lymfocytter. Disse celler er vigtige komponenter i immunsystemet og lokalisere til de primære og sekundære immun organer, såsom knoglemarven, lymfeknuder, milt og andre slimhinde-associerede lymfoide system. Lymfoide neoplasmer er en heterogen gruppe af sygdomme, der er klassificeret baseret på en konstellation af funktioner, herunder morfologi, immunophenotype, genetiske egenskaber og klinisk præsentation. Mens hver parameter spiller en rolle, lineage er fortsat et afgørende træk og danner grundlag for WHO-klassifikationssystem, som anerkender neoplasmer afledt af B-celler, T-celler og natural killer (NK) celler1.
Nøglen til klassificering af lymfom har været karakterisering af antistoffer mod leukocyt overflade markører af lymfocytter2forskellige undertyper. Immunhistokemi (IHC) har traditionelt været brugt til analyse af sådanne mærker og er baseret på princippet om den specifikke antigen-antistof anerkendelse at opdage celle – og tissue-baserede molekyler, der kan visualiseres gennem lysmikroskop 3. identifikation af flere mål på et enkelt dias af konventionelle lysfelt kromogent multiplex IHC har imidlertid begrænsninger fordi det er ofte vanskeligt at skelne mellem flere farve signaler på en enkelt væv sektion pålideligt — især for antigener med en meget lav udtryk4. Visuel bedømmelse og kvantificering af farvning kan også være subjektiv, forårsager variabilitet i den analyse og data fortolkning5.
Konventionelle IHC på formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) prøver er derfor ikke muligt for samtidige påvisning af flere mål i immunologisk forskellige sygdomme som lymfom. Desuden er skelne neoplastiske lymfocytter fra de omkringliggende immunceller ofte upræcise. Dette hindrer undersøgelser, der ser på relevansen af roman biomarkører i lymfom. I denne sammenhæng, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) tilbyder en lovende alternativ, da det giver mulighed for den kvantitative vurdering af antigen coexpression og et rumlige forhold med højere præcision samtidig bevare begrænset prøver6,7. Når denne imaging-teknologi er indgået et samarbejde med digital billed analyse software, data fortolkning er gjort mere effektivt og letter undersøgelsen af tumor og mikromiljø heterogenitet8,9. I denne protokol, en tyramide-baseret immunofluorescens (IF) multiplexing metode anvendes for at forstærke signalet og er kompatibel med enhver IHC-valideret antistof fra enhver vært arter, selv dem, der udvikles i de samme arter5,7 , 10. tyramide-baseret protokol giver mulighed for den direkte konjugering af fluorophore til væv af interesse, således at den primære og sekundære antistof kan fjernes efter hvert trin, giver mulighed for en fortløbende anvendelse af flere pletter uden antistof krydsreaktivitet.
En multiplex strategi vil være nyttige til at forudsige resultater prognose og behandling ved at identificere mål og deres variant immunologiske mønstre i lymfomer. Multiplex fluorescerende IHC er blevet anvendt i vores laboratorium for undersøgelse af et panel af T og B-lymfocytter markører og T-follikulært helper markører i angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL), en undertype af en perifert T-celle lymfom karakteriseret ved aggressiv kliniske adfærd og tumor heterogenitet11. Nytten af denne metode illustreres også i diffus store B-celle lymfom (DLBCL) hvor den øget signalering af en B-celle receptoren med samtidige C-MYC og BCL-2 udtryk tyder på potentiel terapeutisk brug af Brutons tyrosin kinase hæmning 12 .
Beskriver her vi den hele protokol fra antistof validering til udvælgelsen af passende kontrol væv og multiplexing ved hjælp af lymfom FFPE væv, med en eventuel analyse af bejdset dias ved hjælp af en scanning automatiseret kvantitative patologi imaging system.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC har potentiale til at aktiverer patologer forfine diagnosticcriteria i lymfoide patologi og analyserer betydningen af biomarkører i specifikke celletyper mod en forudsigelse af kliniske resultater. Som en ny Forskningsmetode anvendes mf-IHC i stigende grad kvantitative og rumlige identifikation af flere immun parametre af tumor celler17. Påvisning af mf-IHC for fælles udtryk for tumor biomarkører har vist sig at være reproducerbare og pålidelig5. Teknologien er…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. og A.D.J. understøttes af Singapore Ministry of Healths nationale medicinske forskning Rådet overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 og NMRC/TA/0052/2016). Forfatterne anerkender Yong Siew Yoon forskning tilskud til A.D.J. fra den nationale Universitet Cancer Institute i Singapore mod køb af en Vectra spektrale imaging mikroskop. Denne undersøgelse er godkendt af Singapore NHG domæne specifikke Review Board B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
