Multiplex fluorescerende Immunohistochemical flekker, bildebehandling og analyse i histologiske prøver lymfom
Summary
Her beskriver vi en protokoll for multiplex fluorescerende immunohistochemical flekker og tenkelig den samtidige lokalisering av flere kreft-assosiert antigener i lymfom. Denne protokollen kan utvides til colocalization analyse av biomarkers i alle vev inndelinger.
Abstract
Immunohistochemical (IHC) metoder for på plass analyse av protein uttrykk av * lys er et kraftig verktøy for både forskning og diagnostiske formål. Men er visualisering og kvantifisering av flere antigener i et enkelt vev delen bruker konvensjonelle kromogent IHC utfordrende. Multiplex imaging er spesielt relevant i lymfom forskning og diagnostikk, der markører må tolkes i sammenheng med en kompleks svulst microenvironment. Her beskriver vi en protokoll for multiplex fluorescerende IHC flekker for å aktivere kvantitativ vurdering av flere mål i spesifikke celletyper interesse for lymfom. Metoden dekker aspekter av antistoff validering, antistoff optimalisering, multiplex optimalisering med markører av lymfom subtyper, farging av vev microarray (TMA) lysbilder og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse, med bestemt Referanse til lymfom. Bruker denne metoden, genereres score for både bety intensiteten på en markør av interesse og prosent positivitet for å lette videre kvantitativ analyse. Multiplexing minimerer eksempel utnyttelse og gir romlig informasjon for hver indikator.
Introduction
Lymfoide neoplasms skyldes ukontrollert ondartet spredning av lymfocytter. Disse cellene er avgjørende komponenter i immunsystemet og lokalisere til de primære og sekundære immun organene, som benmargen, lymfeknuter, milt og andre mucosa-assosiert lymfoid systemet. Lymfoide svulster er en heterogen gruppe lidelser som klassifiseres basert på en konstellasjon av funksjoner, inkludert morfologi, immunophenotype, særtrekk og kliniske presentasjonen. Mens hver parameter spiller en rolle, avstamning forblir et definerende trekk og danner grunnlaget for WHO klassifikasjonssystem som gjenkjenner neoplasms avledet fra B-celler og T celler naturlig killer (NK) celler1.
Nøkkelen til klassifisering av lymphoma er karakterisering av antistoffer mot leukocytter overflate markører av ulike undertypene av lymfocytter2. Immunohistochemistry (IHC) har vært tradisjonelt brukes for analyse av slike indikatorer og er basert på prinsippet om spesifikt antigen-antistoff anerkjennelse å oppdage celle – og vev-basert molekyler som kan bli visualisert gjennom lys mikroskopet 3. identifikasjon av flere mål på ett lysbilde av konvensjonelle lys-feltet kromogent multiplex IHC har imidlertid begrensninger fordi det er vanskelig å skille flere fargesignaler på en enkelt vev delen pålitelig-spesielt for antigener med en svært lav uttrykk4. Visuell vurdering og kvantifisering av flekker kan også være subjektive, forårsaker variasjon i analysen og data tolkning5.
Konvensjonelle IHC på formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) prøver er derfor ikke mulig for samtidige påvisning av flere mål i immunologisk ulike sykdommer som lymfom. Videre er skille neoplastic lymfocytter fra omkringliggende immunceller ofte upresis. Dette hindrer studier ser på relevansen av romanen biomarkers i lymfom. I denne sammenheng multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) tilbyr en lovende alternativ som det tillater kvantitativ vurdering av antigen coexpression og et romlige forhold med høyere presisjon mens bevaring begrenset prøver6,7. Når denne bildeteknologi er partner med digitalt bilde analyseprogramvare, data tolkningen gjøres mer effektiv og muliggjør studiet av svulsten og microenvironment heterogenitet8,9. I denne protokollen, en tyramide-baserte immunofluorescence (hvis) multipleksing metoden brukes til å forsterke signalet og er kompatibel med noen IHC-godkjent antistoff fra alle vert Art, selv de som er utviklet i samme arter5,7 , 10. tyramide-baserte protokollen tillater direkte Bøyning av fluorophore til vev rundt slik at det primære og sekundære antistoffet kan monteres etter hvert trinn, slik at for sekvensiell anvendelse av flere flekker uten antistoff kryssreaktivitet.
En multiplex strategi vil være nyttig for utstråling prognose og behandling ved å identifisere mål og deres variant immunologic mønstre i lymfomer. Multiplex fluorescerende IHC har vært brukt i vår lab for studier av et panel av T- og B-lymfocytt markører og T-follicular hjelper markører i angioimmunoblastic T-celle lymfom (AITL), en undertype av en ekstern T-celle lymfom preget av aggressiv klinisk atferd og tumor heterogenitet11. Nytten av denne metoden er også illustrert i diffus stor B-celle lymfom (DLBCL) der den økte signalene med en B-celle reseptor med samtidige C-MYC og BCL-2 uttrykket antyder den potensielle terapeutiske bruken av Brutons tyrosin kinase hemming 12 .
Beskriver her vi hele protokollen fra antistoff godkjenningen til valg av aktuelle kontrollen vev og multipleksing bruker lymfom FFPE vev, med en eventuell analyse av farget lysbilder ved hjelp av en skanning automatisert kvantitative patologi bildebehandling system.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC har potensial til å aktivere patologer å avgrense diagnosticcriteria i lymfoide patologi og analysere rollen biomarkers i spesifikke celletyper mot en forutsigelse av kliniske utfallet. Som en ny forskning metoden brukes mf-IHC stadig kvantitative og romlig identifikasjon av flere immun parametere tumor celler17. Gjenkjenning av mf-IHC for co uttrykket av svulst biomarkers har vist å være reproduserbare og pålitelig5. Men fortsatt teknologien begynnende og utset…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. og A.D.J. støttes av Singapore helsedepartementets nasjonale Medical Research Council overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 og NMRC/TA/0052/2016). Forfatterne bekrefter et Yong Siew Yoon forskningsstipend til A.D.J. fra den National University Cancer Institute of Singapore mot kjøp av Vectra spectral tenkelig mikroskop. Denne studien er godkjent av Singapore NHG domene spesifikk gjennomgang styret B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
