Protokollet illustrerar användningen av histopatologisk undersökning och immunohistokemi till Profil folat receptor beta makrofag och dess förhållande till den totala immunceller infiltrera i temporala artären biopsier i jätte cell arterit.
Jätte cell arterit (GCA) är en kronisk immunmedierad sjukdom av medelstora till stora medelstora artärer som drabbar äldre vuxna. GCA godsspecifikationer med artrit och ocklusiva symptom på huvudvärk, stroke eller synförlust. Makrofager och T-hjälparceller lymfocyter infiltrera kärlväggen och producerar proinflammatoriska svar som leder till kärlskada och ischemi. Hittills finns det ingen GCA biomarkör som kan övervaka sjukdomen aktivitet och guide terapeutiskt svar.
Folat receptor beta (FRB) är ett glycosylphosphatidylinositol protein som är förankrade på cellmembran och normalt uttryckt i myelomonocytär härstamning och majoriteten av myeloisk leukemiceller samt i tumören och reumatoid synovial makrofager, där dess uttryck korrelerar med sjukdomens svårighetsgrad. FRB förmåga att binda folat föreningar, folsyra-konjugat och antifolate droger har gjort det ett druggable mål i cancer och inflammatorisk Sjukdomforskning. Rapporten beskriver de histopatologiska och immunohistokemiska metoder att bedöma uttryck och distribution av FRB i förhållande till GCAimmunopathology.
Formalin-fasta och paraffin-inbäddat temporala artären biopsier från GCA och normala kontroller var färgas med Hematoxylin och Eosin att granska vävnad histologi och identifiera patognomona funktioner. Immunohistokemi användes för att upptäcka FRB, CD68 och CD3 uttryck. En mikroskopisk analys utfördes för att kvantifiera antalet positivt färgade celler på 10 markerade hög-High-Power-fältet avsnitt och sina respektive platser i kärlväggen.
Lymphohistiocytic (LH) inflammation åtföljs av intimans hyperplasi och störd elastisk lamina sågs i GCA med ingen hittades i kontroller. Den LH infiltrera bestod av cirka 60% lymfocyter och 40% makrofager. FRB uttrycket var begränsad till makrofager, bestående av 31% av den totala CD68 + makrofag befolkningen och lokaliserad till media och adventitia. Ingen FRB sågs hos kontrollerna.
Detta protokoll visat ett distinkt numeriskt och rumsliga mönster av FRB makrofager i förhållande till den vaskulära immun närmiljön i GCA.
Jätte cell arterit (GCA) är en inflammatorisk sjukdom av medelstora till stora artärer, inriktning aorta och dess grenar och påverkar äldre vuxna. Den presenterar med mild till svår ischemisk komplikationer såsom stroke och vävnad kallbrand, synförlust, käken smärta, huvudvärk. Diagnosen bekräftas av höga inflammatoriska markörer som erytrocyt sänkan (ESR) och en distinkt histopatologiska mönstret på tidsmässiga artär biopsi (fliken)1. GCA är den vanligaste vuxen vaskulit och tillgängligheten i den temporala artären som erhållits för diagnos presenterar en fördel över andra vasculopathies, vilket möjliggör att studera dess patogenes lättare. De typiska fynd på fliken omfatta ett infiltrat av makrofager/histiocyter och T-lymfocyter finns över alla vaskulär lager av tunica intima, media och adventitia med samtidiga förstörelse av den elastiska lamina som normalt skiljer dessa fack2. De aktuella beläggen visar att GCA innebär okända antigen som aktiverar dendritiska celler i vaskulär adventitia, följt av rekrytering av helper T (Th) celler, särskilt Th1 och Th17 undertyper som utsöndra interleukin-17 och interferon-gamma (IFG) respektive. IFG sedan rekryterar och aktiverar makrofager att producera cytokiner och proteaser. Dessa inkluderar pro-inflammatoriska cytokiner; inklusive IL-12, som reciprocally aktiverar Th1 celler vilket ger en positiv feedbackloop; tumörnekrosfaktor och interleukin-6, som orsakar artrit och feber och metalloproteaser som skada den elastiska lamina. Glukokortikoider (GC), som utgör den kroniska standardbehandling, styra delvis cytokin vägar genom förmildrande av Th17/IL-17 men inte Th1/IFG armen av immunsvar3,4. Tyvärr, utsättande av GC resulterar i återfall. Som en alternativ modalitet, metotrexat har varit repurposed för GCA behandling, men de önska kliniska effektmåtten uppnåddes inte konsekvent trots mer känsliga biomarkörer inte har använts för terapeutiskt övervakning5,6 . 2017 godkändes av interleukin-6 blockerare, tocilizumab, för behandling av GCA framgår det effektivt sjukdomskontroll och steroid sparing effekter7,8.
Hittills finns det inga bra biomarkörer för GCA. Som ett resultat, är det svårt att följa sjukdomens aktivitet och titrera doser av tillgängliga läkemedel för att undvika negativa effekter och minska bördan av kostnad för samhället. Därför är det absolut nödvändigt att leta efter en kandidat biomarkör att korrelerar med sjukdomsaktivitet, ger nya insikter om patogenes och stöd i terapeutiska beslut.
Dysreglering av makrofag aktiveringen är en kritisk faktor i GCA patogenes. Ett effektivt sätt att behandla GCA kan således vara selektiv inriktning av aktiverade makrofager. Folat receptor beta (FRB) är en glycosyl-fosfatidylinositol glykoprotein som är förankrad på cellmembranet uttrycks i normala myelomonocytär celler, myeloisk leukemiceller och aktiverade makrofager. Dess ligand, folsyra, är en viktig vitamin i dess reducerade form, vilket möjliggör cellulär DNA syntesen, metylering och reparation9. FRB uttryck induceras i autoimmun sjukdom och under carcinogenes. Dess uttryck är begränsad till ytan av monocyter eller pro-inflammatoriska M1 makrofager i reumatoid artrit eller antiinflammatoriska M2 makrofager i solida organ och myeloida maligniteter10,11,12 , 13. Utöver dess potentiella roll som en biomarkör av aktiverade makrofager, FRB kan aktivera selektiv läkemedelstransport thru en flerstegsprocess som börjar med receptorbindning folsyra, antifolates eller folat-konjugerad droger på cellen yta, följt av internalisering, release och eventuell leverans av önskad drog till inre cell maskiner12,14,15,16. I kontrast till FRB uttryckt i cancerceller och aktiveras makrofager, FRB uttrycks i normala hematopoetiska celler är inte binda folater därigenom säkerställa att FRB/folat-medierad drogen leverans är begränsad till FRB-positiv inflammatorisk eller cancerceller.
I vår tidigare studie, vi visade för första gången som FRB uttrycks i GCA makrofager och dess uttryck korrelerade med CD68 + och endotelin receptor beta makrofager, som bidrar till GCA patogenes17. I den här rapporten beskriver vi den histopatologiska och immunohistokemiska metoder används för att bedöma FRB makrofag och analyseras det totala lymfocyt och makrofag räknas för att få en inblick i den FRB’S position i GCA vaskulär landskapet.
GCA är den vanligaste vaskulit hos vuxna, och dess patologiska hallmark exemplifierar en potent kombination av T-hjälparceller lymfocyter och aktiveras makrofager som kan också hittas i andra granulomatös sjukdomar eller vasculopathies som sarkoidos och granulomatös polyangit2,3. I GCA, den temporala artären ger en bra representation av ett medium till stora storlek artär och TA biopsi ger ett betydande prov som kan lagras i paraffinblock i år, vilket ska…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har gjorts möjlig genom stöd av Dr Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, avdelningen för Reumatologi/Institutionen för medicin och molekylär och histopatologiska Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Microtome | Reichert-Jung | ||
plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
Vertical rack | Fisher Scientific | ||
Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
Xylene | |||
Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
3% hydrogen peroxide in TBS | |||
Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
Placental tissue | for FRB positive control |