Processo innovativo per la stampa 3D Decellularized matrici
Summary
Questo protocollo descrive la produzione di filamenti di policaprolattone (PCL) con microsfere di acido (PLA) incorporato polilattico che contengono matrici decellularizzate (DM) per la stampa 3D del tessuto strutturale ingegneria costrutti.
Abstract
3D multimateriali mira a creare personalizzate impalcature che sono biologicamente attivi e ospitare la dimensione desiderata e la geometria. Un backbone termoplastico in grado di fornire stabilità meccanica simile a tessuto nativo mentre agenti biologici offrono spunti compositivi di cellule progenitrici, che conduce alla loro migrazione, proliferazione e differenziazione di ricostituire i tessuti originali / organi1,2. Purtroppo, molti compatibile di stampa 3D, polimeri bioriassorbibili (come l’acido polilattico, PLA) sono stampati a temperature di 210 ° C o superiore – temperature che sono dannose per farmaci biologici. D’altra parte, policaprolattone (PCL), un diverso tipo di poliestere, è un bioriassorbibili, 3D materiale stampabile che ha una temperatura di stampa più delicata di 65 ° C. Di conseguenza, è stato supposto quello tabella extracellulare decellularizzato (DM) contenuto all’interno di una barriera PLA termicamente protettiva potrebbe essere stampato all’interno del filamento PCL e rimangono nella sua conformazione funzionale. In questo lavoro, osteocondrali riparazione era l’applicazione per cui l’ipotesi è stata provata. Come tale, cartilagine suina era decellularized e incapsulata in acido polilattico (PLA) le microsfere che poi sono state estruse con policaprolattone (PCL) nel filamento per produrre costrutti 3D tramite fusa modellazione a deposizione. I costrutti con o senza le microsfere (PLA-DM/PCL e PCL(-), rispettivamente) sono stati valutati per le differenze nelle caratteristiche della superficie.
Introduction
Attuali tecniche di ingegneria tessutale per applicazioni cliniche come la ricostruzione dell’osso, della cartilagine, tendineo e legamentoso utilizzano auto – e allotrapianti per riparare il tessuto danneggiato. Ognuna di queste tecniche viene eseguita ordinariamente come “gold standard” nella pratica clinica di prima raccolta del tessuto donatore dal paziente o una corrispondenza cadaverica e poi mettendo il tessuto del donatore nel difetto sito2. Tuttavia, queste strategie sono limitate dalla morbilità del sito donatore, scarsità di sito donatore per grandi difetti, rischio di infezione e di difficoltà a trovare gli innesti che corrispondono la geometria desiderata. Inoltre, gli studi hanno indicato che allotrapianti utilizzati per la ricostruzione hanno ridotto proprietà meccaniche e biologiche quando confrontate con tessuto nativo3. Con queste considerazioni in mente, gli ingegneri del tessuto recentemente sono rivolti a tre dimensionale multimateriali (3D) per produrre geometrie personalizzate, complessi che sono biologicamente attivi e progettato per ospitare difetto dimensione e forma, fornendo sufficiente Proprietà meccaniche fino al completamento rimodellamento biologico.
Idealmente, un’impalcatura 3D-stampato consisterebbe in una catena polimerica che può mantenere la necessaria stabilità meccanica del tessuto nativo mentre il biologics incorporato offrono segnali biochimici circostanti cellule, conducente alla loro migrazione, proliferazione, differenziazione e tessuto produzione2,5. Purtroppo, maggior parte dei costrutti contenenti componenti biologici sono fatti con gel o polimeri che sono troppo deboli per resistere alle forze in vivo sperimentati dai tessuti mirati per la ricostruzione di auto/del documento non autografo. Altri polimeri quali acido polilattico (PLA) sono bioriassorbibili, 3D stampabili e strutturalmente suono, ma vengono stampati a temperature pari o superiore a 210 ° C – rendendo impossibile per biologics di essere co-stampato durante la fabbricazione. Policaprolattone (PCL) è un altro polimero bioresorbable autorizzato dal FDA, che può essere stampato ad una temperatura più bassa (65 ° C), che è diventato sempre più popolare nel fabbricare paziente-specifici impianti con morfologie complesse5,6 3D ,7,8,9. Tuttavia, la maggior parte bioprinters utilizzando la tecnologia pneumatica rendono impossibile per la stampa PCL a temperature più basse dove attività biologiche può rimanere illeso. Ad oggi, l’integrazione di questi polimeri con auto/allotrapianti in un romanzo biomateriale stampabile deve ancora essere realizzato. In assenza di tale materiale, è improbabile un approccio vero tessutale per la ricostruzione dei tessuti. Pertanto, abbiamo cercato di combinare PLA, PCL e decellularized matrici dell’allotrapianto (DM) di utilizzare i vantaggi di ogni materiale per produrre un costrutto vitale capace di ricostruire tessuti complessi. Questo processo avrebbe fornito l’iniziale resistenza meccanica necessaria per resistere a forze in vivo e la stabilità termica per ospitare la produzione di additivi in un costrutto che induce la formazione del tessuto desiderato.
In un recente tentativo di affrontare gli ostacoli di cui sopra, abbiamo dimostrato che è fattibile per incapsulare matrice extracellulare della cartilagine decellularizzati all’interno di una barriera PLA termicamente protettiva che può essere estruso all’interno di filamenti PCL, mantenendo la capacità di DM di influenzare circostante host celle2. Questo ci ha ispirato a cercare approcci clinicamente efficaci per la ricostruzione dei tessuti. Nello studio corrente, utilizziamo la tecnologia di piattaforma per costruire impalcature di all-in-one che includono PLA, DM e PCL (PLA-DM/PCL).
Il nostro obiettivo è di migliorare l’efficacia e l’utilità dei documenti non autografo utilizzando la tecnica proposta biofabrication romanzo di ricapitolare più accuratamente tessuto nativo, per poterli utilizzare in definitiva in varie applicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entrambi decellularized matrici e 3D stampato scaffold PCL sono stati indicati in modo indipendente per permettere l’adesione e la proliferazione delle cellule, convalidando il loro uso per osteocondrali riparazione10,11,12. L’uso della matrice decellularizzati in ingegneria approcci alla riparazione tissutale è stato oggetto di molto interesse e successo nel recente passato2,<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato parzialmente finanziato da una sovvenzione da società ortopedica pediatrica del Nord America (POSNA) e il National Institutes of Health concedere NIBIB R21EB025378-01 (assegno di ricerca di Bioingegneria esplorativo).
Materials
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -. T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -. Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -. Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -. Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -. Y., Hsiao, C. -. C., Chen, P. -. Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery – Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
