李斯特菌脑部感染
Summary
在感染过程中,李斯特菌可以通过血脑屏障来殖民大脑。在本协议中, 我们演示了如何评估小鼠感染后器官的细菌定植。为具体测定脑实质中的细菌数, 进行全器官灌注的程序。
Abstract
李斯特菌是一种胞内细菌性致病菌, 常与食物传播的感染有关。L. 李斯特的能力, 通过血脑屏障 (BBB) 是有关的, 因为它可能导致危及生命的脑膜炎和脑炎。脑屏障保护大脑微环境的各种有毒代谢物和微生物病原体发现的血液后感染, 从而支持大脑稳态。在血流中存在的l. 型李斯特菌在脑屏障中的作用机制还没有得到充分的理解, 也缺乏一个健壮的模型系统来研究脑部感染的原因.在这里, 我们提出了一个简单的老鼠感染模型, 以确定是否细菌已经越过脑屏障和定量的负担, 细菌已在体内殖民的大脑。在这种方法中, 动物被静脉注射与L. 李斯特菌, 并被人道安乐死的接触到 CO2 , 其次是颈椎脱位。动物的心脏灌注是在收割被感染的器官之前进行的。血液在灌注前采集, 并通过琼脂板上的血液或器官组织匀浆的电镀稀释和计数形成的菌落数来确定每器官或血毫升的细菌数量。该方法可用于研究新的受体配体相互作用, 增强了李斯特菌的脑部感染, 并可方便地适应多种细菌病原体的研究。
Introduction
革兰氏阳性细菌李斯特菌是一种兼生的胞内病原体, 是世界上最致命的食物传播病原体之一。摄取l-李斯特菌污染的食物会导致人类李斯特菌病, 一种严重的侵袭性疾病, 主要针对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷患者1人。李斯特菌是美国食品传播病原体死亡的主要原因之一, 李斯特菌病的病死率高达 20–30%, 是所有食物传播病原体的最高2。目前尚无疫苗用于L. 李斯特菌和细菌有效地扩散到远端器官和大脑的能力通过血脑屏障 (BBB) 可能导致危及生命的脑膜炎和大脑的殖民化3,4,5,6. 细菌性脑膜炎通常是严重的;虽然大多数接受治疗的人康复, 感染可能会引起严重的并发症,例如, 脑损伤, 听力丧失, 或学习障碍儿童。据预测, 在美国7的社区获得性脑膜炎中,李斯特菌至少占10%。
细菌向大脑和脑膜传播的主要途径是通过血液。在大脑血管中循环的细菌能够穿过脑屏障引起脑部感染。脑屏障是一种高度血管化的屏障系统, 可以保护大脑不受血液中流动的异物的侵害。内皮细胞构成一层线的血管的内部表面8,9。除了L. 李斯特菌, 多种细菌病原体, 如淋球菌奈瑟,肺炎链球菌,大肠杆菌,流感嗜血杆菌b 型 (Hib) 能够殖民化通过脑屏障3,4,5,6的大脑。然而, 当检查被感染老鼠的大脑中的细菌负担时, 确定细菌是否越过了脑屏障是很重要的, 否则, 大脑中的细菌负担可能代表仍然在大脑血管中的细菌。因此, 在确定脑组织匀浆的成藏单元 (CFU) 之前, 必须灌注所有血液中的小鼠。
在本研究中, 我们描述了在体内方法检查的脑细胞增生性李斯特菌感染。在这里描述的方法, 我们使用了 L. 李斯特菌10403S。10.李斯特菌10403S 是最广泛使用的实验室菌株之一, 研究系统性李斯特菌病在小鼠感染模型中的应用。本协议以标准静脉注射的L. 型李斯特菌为基础, 然后灌注小鼠。图 1显示了小鼠感染协议的示意图。从非灌注或灌注小鼠中采集到的李斯特菌感染的大脑和其他器官, 并确定了细菌的器官负担。这些方法不仅可以确定受感染动物的脑部细菌的全殖化, 还有利于确定细菌是否穿透了体内的脑屏障, 以调停大脑的侵袭。必须强调的是, 这项实验室议定书应在与有关的机构生物安全委员会和动物设施管理部门协商后进行。
Protocol
Representative Results
Discussion
李斯特菌能在人类身上造成威胁生命的脑炎。先前的研究表明细菌有能力穿过血脑屏障 (BBB), 并使大脑得以殖民化。在感染过程中提出了三种脑侵袭途径: 通过细菌直接穿透血屏障, 由单个核细胞内的细菌进行隐形转运3, 以及轴突迁移.rhombencephalitis15。因为大脑是高度血管化的, 而l.在系统感染期间, 已知的增生性李斯特菌在血液中循环, 测定<em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到美国国立卫生研究院 AI103806 的资助。
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
