इस प्रोटोकॉल में, हम मानव पूरे रक्त और प्रतिदीप्ति आधारित nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विशिष्ट मार्कर के लक्षण वर्णन से extracellular बुलबुले के तेजी से अलगाव के लिए पूरा कार्यप्रवाह का वर्णन । प्रस्तुत परिणाम reproducibility के एक उच्च स्तर दिखाने के लिए और कोशिका संस्कृति supernatants के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
Extracellular बुलबुले (ईवीएस), exosomes सहित, विशेष झिल्लीदार नैनो आकार के शारीरिक तरल पदार्थ है कि कई सेल प्रकार से जारी constitutively है और सेल-सेल संचार और एक विविध रेंज के विनियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाते पाया बुलबुले हैं जैविक प्रक्रियाओं । ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए कई विभिंन तरीकों का वर्णन किया गया है । हालांकि, इन तरीकों का सबसे नुकसान है कि तैयारी और नमूनों के लक्षण वर्णन बहुत समय लेने वाली हैं, या यह बहुत ही अपने छोटे आकार के कारण ब्याज की विशिष्ट मार्करों का विश्लेषण और असतत की कमी के कारण मुश्किल है आबादी. जबकि ईवीएस के विश्लेषण के लिए तरीके काफी पिछले दशक में सुधार किया गया है, वहां अभी भी एक EV एस के लक्षण वर्णन के लिए कोई मानकीकृत विधि है। यहां, हम प्रतिदीप्ति-आधारित nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा एकल ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक अर्द्ध स्वचालित विधि का प्रदर्शन । प्रोटोकॉल है कि प्रस्तुत किया जाता है इस क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं के आम समस्या पते और PKH67 के साथ ईवीएस और लक्षण वर्णन के तेजी से अलगाव के लिए पूरा कार्यप्रवाह प्रदान करता है, एक सामांय कोशिका झिल्ली linker, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट सतह मार्करों के साथ ऐसे के रूप में CD63, CD9, vimentin, और lysosomal-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन 1 (दीपक-1) । प्रस्तुत परिणाम reproducibility के एक उच्च स्तर दिखाने के लिए, जैसे पश्चिमी सोख्ता के रूप में अंय तरीकों, द्वारा की पुष्टि की । आयोजित प्रयोगों में, हम विशेष रूप से मानव सीरम नमूनों से पृथक ईवीएस इस्तेमाल किया, लेकिन इस विधि भी प्लाज्मा या अन्य शरीर के तरल पदार्थ के लिए उपयुक्त है और सेल संस्कृति supernatants से ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए समायोजित किया जा सकता है. EV जीवविज्ञान पर अनुसंधान के भविष्य की प्रगति की परवाह किए बिना, प्रोटोकॉल है कि यहां प्रस्तुत किया जाता है विशिष्ट मार्करों के साथ एकल ईवीएस के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है ।
Extracellular बुलबुले (ईवीएस), exosomes सहित, विशेष झिल्लीदार नैनो आकार के बुलबुले (20-150 एनएम) लिपिड, आसंजन और सेलुलर संकेत अणुओं, साथ ही अन्य कार्यात्मक cytosolic घटकों के कुछ संयोजनों से युक्त कर रहे हैं जैसे microRNA (miRNA) और mRNA, और सेल-सेल संचार1,2को विनियमित करने में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । ईवीएस कई विभिंन प्रकार के सेल से अपने वातावरण में जारी कर रहे हैं, जैसे, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं, और सीरम वीर्य, मूत्र, स्तन के दूध, लार, या मस्तिष्कमेरु द्रव3 के रूप में शरीर के तरल पदार्थ में पाया जा सकता है, 4. अध्ययन की बढ़ती संख्या कई रोगों के जल्दी निदान और रोग की प्रगति5,6की भविष्यवाणी के लिए संभावित उपमार्क्स के रूप में ईवीएस के विविध योगदान पर प्रकाश डाला । Exosomes अक्सर अणुओं की उपस्थिति है कि वे के साथ विशेष रूप से जुड़े रहे है द्वारा वर्णित हैं, सेल प्रकार वे7से प्राप्त की परवाह किए बिना । उदाहरण के लिए, exosomes में विभिन्न tetraspanins (CD9, CD63, CD81), प्रमुख histocompatibility जटिल वर्ग मैं (MHC i) अणु, विभिन्न transmembrane प्रोटीन, विशिष्ट cytosolic प्रोटीन (tubulin और actin), multivesicular शरीर में शामिल अणुओं ( MVB) (TSG101 और alix), हीट शॉक प्रोटीन (HSP ७० और HSP ९०), और प्रोटीन है कि संकेत transduction (प्रोटीन kinases)8में भाग लेते हैं ।
कई विभिंन तरीकों9ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए किया गया है । EV विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम और प्रचलित तरीके10cytometry, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)11हैं । EV सामग्री के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए सबसे स्थापित और सामांयतः प्रयुक्त विधि पश्चिमी सोख्ता12,13है । जबकि SEM और उनि पूरे आकार स्पेक्ट्रम भर में ईवीएस का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, विशिष्ट सतह प्रोटीन की बहुत ही सीमित पहचान इन तरीकों का एक विशेष नुकसान है । इसके विपरीत, प्रवाह cytometry विशिष्ट EV सतह मार्करों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लेकिन इस विधि की दहलीज विश्लेषण ५०० एनएम से अधिक आकार के साथ ईवीएस करने के लिए सीमा । इसलिए, विशिष्ट सतह मार्करों का पता लगाने के साथ पृथक ईवीएस का विश्लेषण वर्तमान में इन तीन अच्छी तरह से स्थापित तरीकों में से किसी के माध्यम से सुलभ नहीं है । हम पहले दृश्य और ईवीएस, nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्)14के विश्लेषण के लिए एक और अति संवेदनशील तरीका बताया । संक्षेप में, इस विधि दो अलग भौतिक सिद्धांतों को जोड़ती है । पहले, कणों तितर बितर प्रकाश जब वे एक लेज़र बीम के साथ विकिरणित हैं, और दूसरा सिद्धांत, Brownian गति के रूप में जाना जाता है, तात्पर्य है कि एक तरल निलंबन में विभिंन कणों के प्रसार उनके आकार के लिए व्युत्क्रम आनुपातिक है । अर्द्ध स्वचालित डेस्कटॉप nanoparticle विश्लेषण उपकरण तरल नमूनों के लिए एक सॉफ्टवेयर आधारित विश्लेषण के साथ कण ट्रैकिंग विश्लेषक के होते हैं, जहां एकल कणों से बिखरे हुए प्रकाश की डिजिटल छवियों को दर्ज कर रहे हैं । कणों और कणों की आवाजाही एक वीडियो कैमरा के साथ एक लेजर कैटरिंग माइक्रोस्कोप से पता चला रहे हैं. लेजर बीम खड़ी उंमुख है, जबकि ऑप्टिकल अक्ष क्षैतिज और सेल नमूना से भरा चैनल में केंद्रित है । बिखरे हुए प्रकाश स्थलों और गति की उनकी गति के भूखंडों द्वारा प्रदान की डेटा कुल कण गिनती और आकार वितरण के निर्धारण में सक्षम हैं । लेजर द्वारा विकिरण के बाद, कण प्रकाश है, जो14माइक्रोस्कोप के माध्यम से एक डिजिटल वीडियो कैमरा द्वारा दर्ज की गई है तितर बितर । हमारे पूर्व विधि के लिए उंनति एक ५०० एनएम के सम्मिलन लंबी लहर-पास (LWP) लेजर (४८८ एनएम की तरंग दैर्ध्य) और सेल चैनल है, जो प्रतिदीप्ति-लेबल कणों के प्रत्यक्ष विश्लेषण (चित्रा 1) के बीच कट ऑफ फिल्टर । हमारे प्रोटोकॉल एकल ईवीएस के एक तेजी से लक्षण वर्णन के लिए इस क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं की आम मांग के पते, जैसे, उनके पैतृक मूल के अनुसार । इस प्रोटोकॉल में, हम मानव पूरे रक्त और प्रतिदीप्ति आधारित नैनोकणों ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विशिष्ट मार्करों के तेजी से लक्षण वर्णन से ईवीएस के तेजी से अलगाव के लिए पूरा कार्यप्रवाह का वर्णन । ईवीएस PKH67 के साथ दाग से पता लगाया जा सकता है, एक सामांय कोशिका झिल्ली लिंक, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट exosomal मार्करों के साथ, जैसे , CD63, CD9, और vimentin । हमारे प्रोटोकॉल भी EDTA और साइट्रेट प्लाज्मा के लिए उपयुक्त है, साथ ही साथ अंय शरीर के तरल पदार्थ और कोशिका संस्कृति supernatants ।
हम पूरे रक्त और प्रतिदीप्ति-आधारित नैनोकणों ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ विशिष्ट सतह मार्करों के तेजी से लक्षण वर्णन से ईवीएस के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । आयोजित प्रयोगों में, हम विशेष रूप से सीरम के नमूनों से पृथक ईवीएस इस्तेमाल किया, लेकिन इस विधि भी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और साइट्रेट प्लाज्मा के लिए उपयुक्त है और यह भी मूत्र, स्तन के दूध, लार के रूप में अंय शारीरिक तरल पदार्थ के लिए विस्तारित किया जा सकता है, मस्तिष्कमेरु द्रव, और वीर्य । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सेल संस्कृति supernatants से ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए समायोजित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, EV निलंबन १०० μL से सीरम का एक exosome वर्षण रिएजेंट है, जो एक मालिकाना बहुलक है कि धीरे exosomes और ईवीएस 30 एनएम के लिए २०० एनएम से लेकर एक कणिका आकार के अनुसार होता है का उपयोग कर उत्पंन किया गया था, जिससे 10-20 μL ईवीएस के प्रत्येक सतह मार्कर के लक्षण वर्णन के लिए नियुक्त किया गया । दुर्भाग्य से, अलगाव कदम अपरिहार्य है, क्योंकि सीरम नमूनों में प्रोटीन की उच्च मात्रा (जैसे, एल्ब्युमिन और globulin) एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रिया और पृष्ठभूमि और परिष्कृत निष्कर्षों के उच्च स्तर में परिणाम के साथ हस्तक्षेप । इसके अलावा, नमूनों में exosomes की जैविक उपलब्धता के आधार पर, प्रसंस्करण से पहले कार्यरत EV निलंबन की राशि के साथ-साथ अन्य स्रोत सामग्रियों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । कई नमूनों की तुलना करने के लिए, नमूनों के कमजोर पड़ने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सुसंगत अधिग्रहण मापदंडों (संवेदनशीलता, शटर, आदि) आवश्यक है । एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि माप जब तक बहाव कम नहीं है (हमारे हाथ में, < 5 माइक्रोन/ यदि बहाव बहुत अधिक था, नमूना का दोहराया माप खुद के बीच उच्च मानक विचलन उपज, लेकिन एक कम बहाव के साथ, परिणामी डेटा अत्यधिक संगत थे और reproducibility के एक उच्च स्तर की पुष्टि की. यह महत्वपूर्ण है कि चयनित एंटीबॉडी एक उपयुक्त fluorochrome है । एंटीबॉडी Alexa Fluor ४८८ के साथ संयुग्मित होना चाहिए, क्योंकि FITC फोटो ब्लीचिंग की एक उच्च दर है । संभवतः अधिक स्थिर fluophores निश्चित रूप से भविष्य में वृद्धि की परख स्थिरता के लिए नेतृत्व करेंगे । आम तौर पर, कई शोधकर्ताओं EV एस के लिए एक मंदक के रूप में पंजाबियों का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, यह EV निलंबन के लिए एक मंदक के रूप में आसुत जल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब ईवीएस fluorescing रंजक के साथ लेबल कर रहे हैं, उच्च परासरणीयता और ऐसे पंजाबियों के रूप में अंय diluents की आयन एकाग्रता, माप के साथ हस्तक्षेप और बदल परिणामों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
जबकि ईवीएस के विश्लेषण के लिए तरीके काफी पिछले दशक में सुधार किया गया है, वहां अभी भी अलगाव और EV s के लक्षण वर्णन के लिए कोई मानकीकृत विधि है। प्रवाह cytometry के प्रमुख नुकसान, जहां ईवीएस अक्सर मोती के लिए एक बड़ा सतह प्रदान करने के लिए बाध्य कर रहे हैं, यह है कि सतह पर कई ईवीएस गोदी के लिए एक मजबूत और जासूसी संकेत10प्रदान करते हैं । SEM और उनि नुकसान है कि नमूनों की तैयारी समय लेने वाली है और ईवीएस केवल उनके आकार और आकृति विज्ञान11द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । अप टू डेट, गुणात्मक के लिए सबसे स्थापित और आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि (यानी, जैव रासायनिक) EV लक्षण वर्णन पश्चिमी सोख्ता, जहां प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी12,13के साथ विश्लेषण किया जा सकता है । हालांकि, इन सभी तरीकों के नुकसान विशिष्ट सतह मार्करों के लिए एकल ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए अक्षमता में झूठ । इसके अलावा, लंबे समय प्रसंस्करण समय और लंबे समय से धोने/अलगाव प्रक्रियाओं वर्तमान प्रोटोकॉल के कई द्वारा प्रयुक्त श्रम गहन कदम शामिल है, उंहें उच्च नमूना प्रवाह और एकल EV s के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं बना। हमारा प्रोटोकॉल ऐसे CD63, CD9, vimentin, और CD107a के रूप में विशिष्ट सतह मार्करों के साथ त्वरित अलगाव और एकल ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक पूर्ण कार्यप्रवाह प्रदान करता है, और अंय सतह मार्करों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए विस्तारित किया जा सकता है की उत्पत्ति का निर्धारण जारी ईवीएस. ंत् डिवाइस की एक स्थाई तकनीकी प्रगति की वजह से, हम नवीनतम विश्लेषक के साथ निर्माता के साथ सहयोग में हमारे निष्कर्षों की पुष्टि की । EV जीवविज्ञान पर अनुसंधान के भविष्य की प्रगति की परवाह किए बिना, विशेष रूप से exosomes के विषय में, प्रोटोकॉल है कि यहां प्रस्तुत किया जाता है विशिष्ट मार्करों के साथ एकल ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय विधि प्रदान करेगा । क्योंकि अलगाव और धुंधला प्रक्रिया के दौरान ईवीएस का एकत्रीकरण अभी तक अपरिहार्य है, भविष्य के अनुसंधान के तरीकों को विकसित करने के लिए ev एकत्रीकरण को रोकने और फ्लोरोसेंट-लेबल ev s का एक सटीक आकार निर्धारण सक्षम करने के लिए ध्यान केंद्रित करना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों का शुक्र है कण Metrix GmbH आंशिक रूप से इस काम के प्रकाशन लागत को कवर करने के लिए ।
Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |