Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven
Summary
We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.
Abstract
Kwantificering van proteïnen van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE) is belangrijk in de klinische en onderzoek toepassingen. Een optimale methode voor de kwantificering klopt, heeft een ruime lineaire dynamisch bereik en onderhoudt de structurele integriteit van het monster dat voor de identificatie van individuele celtypes. Huidige methoden zoals immunohistochemistry (IHC) en massaspectrometrie immunoblotting elk niet voldoen aan deze bepalingen als gevolg van hun categoriale aard of moeten het homogeniseren van het monster. Als een alternatieve methode, stellen wij voor het gebruik van Immunofluorescentie (IF) en beeldanalyse te bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in FFPE weefsels. Hierin aantonen we dat deze methode is eenvoudig geoptimaliseerd, een breed dynamisch bereik levert, en lineair kwantificeerbare ten opzichte van de gouden standaard van kwantitatieve immunoblotting. Bovendien, deze methode maakt het onderhoud van de structurele integriteit van het monster en zorgt voor het onderscheid van verschillende celtypes, die cruciaal zijn in diagnostische toepassingen kunnen zijn. Globaal, dit is een robuuste methodiek voor de relatieve kwantificering van eiwitten in FFPE monsters en kan gemakkelijk aangepast worden aan pak klinische of onderzoekbehoeften.
Introduction
De noodzaak om te kwantificeren van eiwitten in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefselsteekproeven bestaat in veel klinische gebieden. Kwantificering van biomerker eiwitten in routine biopsie exemplaren wordt bijvoorbeeld gebruikt te verhelderen van prognose en behandeling van kanker patiënten1te informeren. Echter, huidige methoden zijn typisch subjectief en gebrek aan validatie.
Immunohistochemistry (IHC) wordt regelmatig gebruikt in laboratoria van de pathologie en over het algemeen hangt een primair antilichaam gericht op het doel-eiwit en een secundair antilichaam geconjugeerd met een enzymatische label zoals horseradish peroxidase2. Conventionele IHC is gevoelig, kan maken gebruik van minuut monsters en behoudt de morfologische integriteit van weefselmonsters zodoende beoordeling van eiwit expressie binnen zijn relevante histologische context mogelijk te maken. Echter, omdat het chromogenic signaal gegenereerd door IHC subtractieve, het lijdt aan een relatief smalle dynamisch bereik en biedt beperkte mogelijkheden voor multiplexing van2,3,4. Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI-MSI) behoudt morfologische integriteit. Echter deze ontwikkelende technologie wordt geassocieerd met bescheiden morfologische resolutie en vereist significante kalibratie en normalisatie, afbreuk te doen aan de haalbaarheid ervan voor klinische routinegebruik5,6,7. Alternatieve technieken te kwantificeren van eiwit in weefselsteekproeven omvatten immunoblotting8, massaspectrometrie9,10,11, en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, elke van die met een gehomogeniseerde begint lysate steekproef weefsel. Primaire weefselsteekproeven zijn heterogene in dat zij een veelheid van soorten cellen bevatten. Daarom, technieken die met zich meebrengen homogenisatie van de monsters niet toegestaan kwantificering van een proteïne in een bepaalde cel bevolking van belang zoals kankercellen.
Zoals IHC, indien van toepassing is op kleine FFPE monsters en het behoud van de integriteit van de histologische13vergunningen. Echter dankzij de additieve aard van fluorescentie signalen, als is vatbaar voor de toepassing van meerdere primaire antilichamen en fluorescerende etiketten. Dus, een proteïne van belang relatief kan worden gekwantificeerd in bepaalde cellen of cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld kern versus cytoplasma) gedefinieerd met behulp van andere antistoffen. Fluorescentie signalen hebben ook het voordeel van een groter dynamisch bereik13,14. De superioriteit, de reproduceerbaarheid en de multiplexing potentieel van geweest als toegepast op de FFPE monsters aangetoonde13,14,15.
Hierin beschrijven we het gebruik van kwantitatieve immunoblotting met behulp van bestaande cellijnen als een gouden standaard om na te gaan van de kwantitatieve aard van als in combinatie met de computer-assisted beeldanalyse bij het bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in histologische secties van FFPE weefselmonsters. Wij hebben deze methode met succes in een multiplex aanpak te kwantificeren biomerker eiwitten in klinische biopsie monsters16,17,18toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij hebben een methode beschreven dat maakt gebruik van kwantitatieve immunoblotting (IB) om aan te tonen het nut van Immunofluorescentie (IF) voor het vaststellen van de relatieve overvloed van een doel-eiwitten in FFPE weefselmonsters. Huidige eiwit kwantificering methoden worden beperkt door hun categorische aard, zoals chromogenic IHC2,3, of door de noodzaak om het homogeniseren van monsters, voorkomen van onderzoek naar de monster-structuur en cel populaties…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Fredrick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs (A.M.).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
