Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren
Summary
Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.
Abstract
Quantifizierung der Proteine des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben ist wichtig in der klinischen und Forschung Anwendungen. Eine optimale Methode zur Quantifizierung stimmt, hat einen breiten linearen Dynamikbereich und unterhält die strukturelle Integrität der Probe zur Identifizierung der einzelnen Zelltypen zu ermöglichen. Aktuelle Methoden wie Immunhistochemie (IHC), Massenspektrometrie und Immunoblotting jeweils nicht erfüllen diese Bestimmungen aufgrund ihrer kategorischen oder brauchen, um die Probe zu homogenisieren. Als eine alternative Methode schlagen wir die Verwendung von Immunfluoreszenz (IF) und Bildanalyse, die relative Häufigkeit eines Proteins des Interesses an FFPE Gewebe zu bestimmen. Hier zeigen wir, dass diese Methode ist leicht optimiert, einen breiten dynamischen Bereich liefert und im Vergleich zu der Goldstandard der quantitativen Immunoblotting linear quantifizierbar ist. Darüber hinaus ist diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Probe und ermöglicht die Unterscheidung der verschiedenen Zelltypen, die im diagnostischen Anwendungen entscheidend sein können. Insgesamt, dies ist eine robuste Methode für die relative Quantifizierung von Proteinen in FFPE-Proben und kann leicht an klinischen passen oder Forschung muss angepasst werden.
Introduction
Die Notwendigkeit zur Quantifizierung von Proteinen in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsie Gewebeproben existiert in vielen klinischen Bereichen. Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben wird beispielsweise zur aufzuklären Prognose und Behandlung für Krebs Patienten1zu informieren. Jedoch aktuelle Methoden sind in der Regel subjektiv und Validierung fehlt.
Immunhistochemie (IHC) dient routinemäßig in der Pathologie-Laboratorien und hängt im Allgemeinen von einer primären Antikörper gegen das Zielprotein und ein mit einem enzymatischen Label wie Meerrettich Peroxidase2konjugierten Sekundärantikörper. Konventionelle IHC ist empfindlich, kann Gebrauch von Minute Proben und bewahrt die morphologische Integrität von Gewebeproben, die dadurch bei schönem Bewertung der Proteinexpression in seinem entsprechenden histologischen Kontext. Jedoch weil das chromogene vom IHC erzeugte Signal subtraktiven ist, leidet unter einem relativ engen Dynamikbereich und bietet begrenzten Potential für multiplexing2,3,4. Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI-MSI) bleibt morphologischen Integrität. Allerdings diese entwickelnden Technologie ist verbunden mit einer bescheidenen morphologische Auflösung und erfordert erhebliche Kalibrierung und Normalisierung, beeinträchtigen seine Machbarkeit für klinische Routineanwendung5,6,7. Alternative Verfahren zur Quantifizierung von Protein in Gewebeproben gehören Immunoblotting8, Massenspektrometrie9,10,11und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)12, jedes Das beginnt mit einer homogenisierten Probe Gewebe lysate. Primäre Gewebeproben sind heterogen, weil sie eine Vielzahl von Zelltypen enthalten. Daher erlauben Techniken, die zur Folge haben, Homogenisieren der Proben keine Quantifizierung eines Proteins in einer bestimmten Zelle Bevölkerung von Interesse, wie Krebszellen.
Wie IHC, wenn gilt für kleine FFPE Proben und ermöglicht die Beibehaltung der histologischen Integrität13. Aber dank dem Additiven Charakter der Fluoreszenz Signale, wenn für die Anwendung von mehreren primären Antikörper und Fluoreszenzmarkierungen zugänglich ist. So kann ein Protein des Interesses relativ innerhalb bestimmter Zellen oder zellulären Kompartimenten (z. B. Zellkern und Zytoplasma) mit anderen Antikörpern definiert quantifiziert werden. Fluoreszenz-Signale haben auch den Vorteil eines größeren Dynamikbereich13,14. Die Überlegenheit, Reproduzierbarkeit und multiplexing Potential wurde wenn auf FFPE-Proben angewendet demonstriert13,14,15.
Hier beschreiben wir die Verwendung von quantitativen Immunoblotting mit etablierten Zelllinien als Goldstandard quantitative Artder festzustellen, ob in Verbindung mit computergestützten Bildanalyse bei der Bestimmung der relativen Fülle eines Proteins des Interesses an histologischen Abschnitte aus FFPE Gewebeproben. Wir haben diese Methode erfolgreich in einem Multiplex-Ansatz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in klinischen Biopsie Proben16,17,18angewandt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine Methode beschrieben, dass der quantitativen Immunoblotting (IB) nutzt, um das Dienstprogramm Immunfluoreszenz (IF) zeigen für die Ermittlung der relativen Fülle an ein Zielprotein in FFPE Gewebeproben. Aktuelle Protein Quantifizierungsmethoden beschränken sich naturgemäß kategorische, z. B. chromogenen IHC2,3, oder durch die Notwendigkeit, Proben, Untersuchung der Beispielbeständen Struktur und Zelle zu verhindern, wie z. B. Homogenisieren mi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Fredrick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium (Uhr) finanziert.
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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