एक मानक के रूप में सेल लाइनों की मात्रात्मक Immunoblotting नियमित ऊतक नमूनों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अचिह्नित प्रोटीन को प्रमाणित करने के लिए
Summary
हम मात्रात्मक immunoblotting के उपयोग का वर्णन करने के लिए formalin में ब्याज की एक प्रोटीन को बढ़ाता है के रूप में छवि विश्लेषण के साथ युग्मित इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल मांय-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक के नमूने । हमारे परिणाम इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल की उपयोगिता नियमित बायोप्सी नमूनों में विमार्कर प्रोटीन के सापेक्ष मात्रा का पता लगाने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
Abstract
formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक नमूनों में रुचि के प्रोटीन की ठहराव नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण है । ठहराव का एक इष्टतम विधि सटीक है, एक व्यापक रैखिक गतिशील रेंज है और अलग-अलग सेल प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देने के लिए नमूने की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है । ऐसे immunohistochemistry (आइएचसी), मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और immunoblotting के रूप में मौजूदा तरीकों को अपने स्पष्ट प्रकृति या नमूना homogenize की जरूरत के कारण इन शर्तों को पूरा करने में विफल । एक वैकल्पिक विधि के रूप में, हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस के उपयोग का प्रस्ताव (IF) और छवि विश्लेषण के लिए FFPE ऊतकों में ब्याज की एक प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करते हैं । इस के साथ साथ हम प्रदर्शन है कि इस विधि को आसानी से अनुकूलित है, एक व्यापक गतिशील रेंज पैदावार, और रैखिकता quantifiable है के रूप में मात्रात्मक immunoblotting के सोने के मानक की तुलना में । इसके अलावा, इस विधि नमूने के संरचनात्मक अखंडता के रखरखाव परमिट और विभिंन प्रकार के सेल के भेद के लिए अनुमति देता है, जो नैदानिक अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण हो सकता है । कुल मिलाकर, यह FFPE नमूनों में प्रोटीन के सापेक्ष ठहराव के लिए एक मजबूत तरीका है और आसानी से नैदानिक या अनुसंधान की जरूरत के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक बायोप्सी के नमूनों में प्रोटीन यों को बढ़ाता है कई नैदानिक क्षेत्रों में मौजूद है । उदाहरण के लिए, नियमित बायोप्सी नमूनों में ठहराव के लिए एक मार्की प्रोटीन का पूर्वानुमान स्पष्ट और कैंसर के रोगियों के लिए उपचार को सूचित करने के लिए प्रयोग किया जाता है1. हालांकि, वर्तमान विधियाँ व्यक्तिपरक और कमी सत्यापन सामांयतया हैं ।
Immunohistochemistry (आइएचसी) विकृति प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है और आम तौर पर एक प्राथमिक लक्ष्य प्रोटीन और संयुग्मित एंजाइमी2जैसे सहिजन लेबल के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी peroxidase पर निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है । पारंपरिक आइएचसी संवेदनशील है, मिनट के नमूनों का उपयोग कर सकते है और ऊतक नमूनों की रूपात्मक अखंडता को बरकरार रखता है जिससे इसके प्रासंगिक ऊतकवैज्ञानिक संदर्भ में प्रोटीन अभिव्यक्ति के आकलन की अनुमति । हालांकि, क्योंकि आइएचसी द्वारा उत्पंन chromogenic संकेत बाधक है, यह एक अपेक्षाकृत संकीर्ण गतिशील रेंज से ग्रस्त है और मल्टीप्लेक्स2,3,4के लिए सीमित क्षमता प्रदान करता है । मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी-MSI) रूपात्मक अखंडता को बरकरार रखता है । हालांकि, इस विकासशील प्रौद्योगिकी मामूली रूपात्मक संकल्प के साथ जुड़ा हुआ है और महत्वपूर्ण अंशांकन और सामान्यीकरण की आवश्यकता है, नियमित नैदानिक उपयोग के लिए अपनी व्यवहार्यता बिगड़ना5,6,7. वैकल्पिक तकनीक ऊतक नमूनों में प्रोटीन यों तो immunoblotting8, मास स्पेक्ट्रोमेट्री9,10,11, और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)12शामिल हैं, प्रत्येक जो की एक नमूना ऊतक के homogenized lysate के साथ शुरू होता है । प्राथमिक ऊतक के नमूनों में विषम है कि वे कोशिका प्रकार के एक भीड़ शामिल हैं । इसलिए, तकनीकों कि नमूनों अनुमन्य करने की अनुमति नहीं है एक प्रोटीन के ठहराव के एक विशेष सेल में कैंसर की कोशिकाओं के रूप में ब्याज की आबादी ।
आइएचसी की तरह, अगर छोटे FFPE नमूनों के लिए लागू है और ऊतकवैज्ञानिक अखंडता13के प्रतिधारण परमिट । हालांकि, प्रतिदीप्ति संकेतों के additive प्रकृति के लिए धंयवाद, यदि कई प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट लेबल के आवेदन के लिए उत्तरदाई है । इस प्रकार, ब्याज की एक प्रोटीन विशिष्ट कोशिकाओं या सेलुलर डिब्बों के भीतर अपेक्षाकृत quantified हो सकता है (उदाहरण के लिए, नाभिक बनाम कोशिका द्रव्य) अंय एंटीबॉडी का उपयोग कर परिभाषित । प्रतिदीप्ति संकेतों को भी एक बड़ा गतिशील रेंज13,14का लाभ है । यदि FFPE नमूनों पर लागू की गई श्रेष्ठता, reproducibility और division क्षमता का प्रदर्शन13,14,15को किया गया है ।
इस के साथ साथ हम मात्रात्मक immunoblotting के प्रयोग का वर्णन एक सोने के मानक के रूप में स्थापित सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए यदि कंप्यूटर के साथ युग्मित की मात्रात्मक प्रकृति का पता लगाने में ब्याज की एक प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत निर्धारण में छवि विश्लेषण की सहायता FFPE ऊतक नमूनों से ऊतकवैज्ञानिक वर्गों । हम एक मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण में इस पद्धति को सफलतापूर्वक लागू किया है नैदानिक बायोप्सी नमूने16,17,18में मार्कर प्रोटीन यों तो ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक तरीका है कि मात्रात्मक immunoblotting (आईबी) के उपयोग के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस की उपयोगिता प्रदर्शित करता है वर्णन किया है (यदि) FFPE ऊतक नमूनों में एक लक्ष्य प्रोटीन के सापेक्ष बहुतायत का पता लगाने के लिए । व?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से Fredrick बंटिंग और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति (A.M.) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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