Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine
Summary
Descriviamo l’uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l’istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell’immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l’utilità dell’istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.
Abstract
Quantificazione di proteine di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è importante negli studi clinici e applicazioni di ricerca. Un metodo ottimale di quantificazione è accurato, ha un’ampia gamma dinamica lineare e mantiene l’integrità strutturale del campione per consentire per l’identificazione dei tipi di cella singola. Attuali metodi quali immunohistochemistry (IHC), spettrometria di massa e immunoblotting ciascuno non riescono a soddisfare queste stipulazioni dovuto la loro natura categoria o bisogno di omogeneizzare il campione. Come metodo alternativo, proponiamo l’uso di immunofluorescenza (IF) e analisi dell’immagine per determinare l’abbondanza relativa di una proteina di interesse in tessuti FFPE. Qui dimostriamo che questo metodo è facilmente ottimizzato, produce un’ampia gamma dinamica e linearmente quantificabile rispetto il gold standard di immunoblotting quantitativa. Inoltre, questo metodo consente il mantenimento dell’integrità strutturale del campione e per la distinzione dei vari tipi di cellule, che può essere cruciale in applicazioni diagnostiche. Nel complesso, questo è un metodo affidabile per la quantificazione relativa delle proteine in campioni FFPE e può essere facilmente adattato per soddisfare le cliniche o esigenze di ricerca.
Introduction
La necessità di quantificare le proteine nei campioni di biopsia di tessuto (FFPE) da formalina-fisse, paraffina-incastonato esiste in molti campi clinici. Ad esempio, quantificazione delle proteine di biomarcatore negli esemplari di biopsia di routine è usato per delucidare la prognosi e informare il trattamento per cancro pazienti1. Tuttavia, gli attuali metodi sono in genere soggettivi e mancano di convalida.
Immunohistochemistry (IHC) è usato ordinariamente nei laboratori di patologia e generalmente dipende da un anticorpo primario direzionati alla proteina bersaglio e un anticorpo secondario coniugato con un’etichetta enzimatica come rafano perossidasi2. IHC convenzionale è sensibile, può fare uso di minuto campioni e preserva l’integrità morfologica dei campioni di tessuto, permettendo la valutazione dell’espressione della proteina all’interno del contesto istologico pertinente. Tuttavia, perché il segnale cromogenico generato da IHC è sottrattivo, soffre di un intervallo relativamente ristretto di dinamico e offre un potenziale limitato per multiplexing2,3,4. Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-MSI) di imaging preserva l’integrità morfologica. Tuttavia, questa tecnologia in via di sviluppo è associata con modesta risoluzione morfologiche e richiede notevole calibrazione e normalizzazione, alterando la sua fattibilità per uso clinico sistematico5,6,7. Tecniche alternative per quantificare le proteine nei campioni di tessuto comprendono immunoblotting8, spettrometria di massa9,10,11ed enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) dosaggio12, ogni che comincia con un omogeneizzato lysate del tessuto del campione. Campioni di tessuto primario sono eterogenei, in quanto contengono una moltitudine di tipi di cellule. Di conseguenza, le tecniche che comportano l’omogeneizzazione dei campioni non consentono quantificazione di una proteina in una popolazione particolare cella di interesse come le cellule tumorali.
Come IHC, se è applicabile al piccolo FFPE campioni e consente il mantenimento di integrità istologica13. Tuttavia, grazie alla natura additiva dei segnali di fluorescenza, se è favorevole all’applicazione di molteplici anticorpi primari ed etichette fluorescenti. Così, una proteina di interesse può essere quantificata relativamente all’interno di celle specifiche o compartimenti cellulari (ad esempio, nucleo e citoplasma) definite utilizzando altri anticorpi. Segnali di fluorescenza hanno anche il vantaggio di una maggiore gamma dinamica13,14. La superiorità, la riproducibilità e la potenziale multiplexing di se applicato a campioni FFPE è stata dimostrata13,14,15.
Qui descriviamo l’uso di quantitativi immunoblotting utilizzando linee cellulari stabilizzate come gold standard per accertare la natura quantitativa di se accoppiato con analisi di immagine computerizzata nel determinare l’abbondanza relativa di una proteina di interesse in sezioni istologiche dai campioni di tessuto FFPE. Abbiamo applicato questo metodo con successo in un approccio multiplex per quantificare le proteine biomarcatore in clinica biopsia campioni16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto un metodo che fa uso di quantitativi immunoblotting (IB) per dimostrare l’utilità di immunofluorescenza (IF) per accertare l’abbondanza relativa di una proteina dell’obiettivo nei campioni di tessuto FFPE. Attuali metodi di quantificazione della proteina sono limitati nella loro natura categorica, come cromogenico IHC2,3, o dalla necessità di omogeneizzare campioni, impedendo di indagine nelle popolazioni delle cellule e la struttura del campi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Fredrick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship (A.M.).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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