면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting
Summary
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.
Abstract
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질의 정량화는 임상에서 중요 한 응용 프로그램을 연구 하는 고. 정량화 하는 최적의 방법 정확 하 고 광범위 한 선형 동적 범위를가지고 개별 세포 유형의 식별 수 있도록 샘플의 구조적 무결성을 유지 합니다. Immunohistochemistry (IHC), 질량 분석 등 immunoblotting 현재 방법 각 그들의 범주 특성상 이러한 규정에 맞게 실패 또는 샘플을 균질 필요가 있다. 대체 방법으로 우리는 면역 형광 검사 (IF) 및 FFPE 조직에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 이미지 분석의 사용을 제안 합니다. 여기이 방법은 쉽게 최적화 된 넓은 동적 범위를 산출 및 선형 양적 immunoblotting의 황금 표준에 비해 정량은 설명 합니다. 또한,이 메서드는 샘플의 구조적 무결성의 유지 관리를 허용 하 고 진단 응용 프로그램에 중요 한 있을 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구별 허용 합니다. 전반적으로,이 FFPE 샘플에 있는 단백질의 상대적 정량화에 대 한 강력한 방법 이며 임상 적응 하거나 요구를 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 생 검 견본에 있는 단백질을 정할 필요가 많은 임상 분야에 존재 합니다. 예를 들어 일상적인 생 검 표본에서 바이오 마커 단백질의 정량화는 암 환자1에 대 한 치료 예 후를 명료 하 사용 됩니다. 그러나, 현재 메서드는 일반적으로 주관적 및 유효성 검사 부족.
Immunohistochemistry (IHC) 병 리 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 일반적으로 1 차적인 항 체 대상 단백질에 지시 및 양 고추냉이 과산화 효소2등 효소 상표로 활용 된 이차 항 체에 따라 달라 집니다. 기존의 IHC 구분, 만들 수 있습니다 사용 분의 샘플링 하 고 그로 인하여 그것의 관련 조직학 컨텍스트 내에서 단백질 식의 평가 허용 하는 조직 샘플의 형태학 무결성을 보존 한다. 그러나, IHC에 의해 생성 된 비 신호 빼기 때문에, 그것은 상대적으로 좁은 동적 범위에서 겪고 있다 고 멀티플렉싱2,,34에 대 한 제한 된 잠재력을 제공. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI-MSI) 이미징 형태학의 무결성을 유지 합니다. 그러나,이 개발 기술 겸손 형태학 해상도와 연결 하며 중요 한 보정 및 정규화, 일상 임상 사용5,,67에 대 한 그것의 타당성을 방해. 단백질 조직 샘플에서 계량을 대체 기술을 포함 immunoblotting8,11, 질량 분석의9,10,및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)12, 각 이 무 균으로 시작의 샘플 조직의 lysate. 기본 조직 샘플은 다른 유형의 다양 한 세포 유형 포함. 따라서, 조직 샘플 수반 기법 암 세포 같은 관심의 특정 세포 인구에서 단백질의 정량화를 허용 하지 않습니다.
IHC, 만약에 작은 적용 됩니다 처럼 FFPE 샘플링 하 고 조직학 무결성13의 보존 합니다. 그러나, 덕분에 형광 신호, 첨가제 자연 경우 의무가 여러 기본 항 체와 형광 라벨의 응용 프로그램입니다. 따라서, 관심사의 단백질 특정 셀 또는 세포질 구획 (예를 들어 핵 및 세포질) 다른 항 체를 사용 하 여 정의 내에서 상대적으로 측정할 수 있습니다. 형광 신호는 또한 더 큰 동적 범위13,14의 이점을. 우수성, 재현성, 및의 멀티플렉싱 잠재력 FFPE 샘플에 적용 하는 경우 시연된13,,1415되었습니다.
여기 우리 골드 표준으로 설립된 셀 라인을 사용 하 여 만약에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정에서 컴퓨터 기반 이미지 분석의 양적 성격을 확인 하는 양적 immunoblotting의 사용 설명 FFPE 조직 샘플에서 조직학 섹션입니다. 우리는 성공적으로 임상 생 샘플16,,1718바이오 마커 단백질을 계량 하는 다중 접근에서이 메서드를 적용 했습니다.
Protocol
기본 인간의 조직 샘플을 사용 하 여 승인 보건 복지부 산하 교육 병원 연구 윤리 위원회 (HSREB) 여왕의 대학에서 얻은 했다. 1. 건물 셀 라인 조직 Microarray (TMA) 수확 하 고 세포를 씻어.참고:이 프로토콜 (예: 헬러, Jurkat, RCH ACV) 다양 한 설립된 불멸 하 게 셀 라인에서 테스트 되었습니다. 부착 세포, 그들은 약 80 %confluency 도달 약 1.3 x 107 셀을 수확. …
Representative Results
이 프로토콜 FFPE 직물 구획으로 만든 셀 라인에서 안티-apoptotic 단백질 Bcl-2의 상대 수량을 결정 하는 경우의 기능 확인을 위해 사용 되었다. 암 세포에 선택적으로 측정 Bcl-2 종양 메커니즘을 명료 하 게 수 고 병 적인 진단 및 임상 관리 결정24알리는에서 유용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, Bcl-2 적절 한 B-lymphocyte 개발에 역할 그리고의 식은 일반적으로…
Discussion
메서드를 설명 하는 우리가 사용 하는 양적 immunoblotting (IB)의 면역 형광 검사 (면)의 유틸리티를 보여 FFPE 조직 샘플에서 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 ascertaining에 대 한. 현재 단백질 정량화 방법 비 IHC2,3, 등 그들의 명백한 자연 또는 균질 샘플, 샘플 구조와 세포 인구에 대 한 조사와 같은 방지 하는 필요에 의해 제한 됩니다. IB 및 질량 분석<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 프레드릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (오전)에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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Citer Cet Article
Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, S., LeBrun, D. P. Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples. J. Vis. Exp. (143), e58735, doi:10.3791/58735 (2019).