Kvantitativa Immunoblotting cellinjer som Standard att validera immunofluorescens för att kvantifiera biomarkör proteiner i rutinmässiga vävnadsprover
Summary
Vi beskriver användningen av kvantitativa immunoblotting att validera immunofluorescens histologi tillsammans med bildanalys som ett sätt att kvantifiera ett protein av intresse i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover. Våra resultat visar nyttan av immunofluorescens histologi för att fastställa den relativa mängden biomarkör proteiner i rutinmässiga biopsiprover.
Abstract
Kvantifiering av proteiner av intresse i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover är viktigt i kliniska och forskningsansökningar. En optimal metod för kvantifiering är korrekt, har en bred linjär dynamisk räckvidd och underhåller den strukturella integriteten av provet som möjliggör identifiering av enskilda celltyper. Nuvarande metoder såsom immunhistokemi (IHC), masspektrometri och immunoblotting var misslyckas att uppfylla dessa bestämmelser på grund av sin kategoriska natur eller behöva Homogenisera provet. Som en alternativ metod föreslår vi användningen av immunofluorescens (om) och bildanalys avgöra det relativa överflödet av ett protein av intresse i FFPE vävnader. Häri visar vi att denna metod är enkelt optimerad, ger ett brett dynamiskt omfång och är linjärt kvantifierbara jämfört med den gyllene standarden för kvantitativa immunoblotting. Dessutom denna metod möjliggör upprätthållandet av den strukturella integriteten av provet och tillåter för skillnaden av olika celltyper, som kan vara avgörande för diagnostik program. Övergripande, detta är en robust metod för relativ kvantifiering av proteiner i FFPE-prover och lätt kan anpassas att passa klinisk eller forskningsbehov.
Introduction
Behovet av att kvantifiera proteiner i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) biopsi vävnadsprover finns i många kliniska områden. Till exempel används kvantifiering av biomarkör proteiner i rutinmässig biopsi prov för att belysa prognos och informera behandling för cancer patienter1. Men nuvarande metoder är vanligtvis subjektiva och saknar validering.
Immunhistokemi (IHC) används rutinmässigt i patologi laboratorier och beror i allmänhet på en primär antikropp riktad mot målproteinet och en sekundär antikropp konjugerat med en enzymatisk etikett såsom pepparrotperoxidas2. Konventionella IHC är känsliga, kan göra användning av minut prover och bevarar den morfologiska integriteten av vävnadsprover som därmed tillåter bedömning av proteinuttryck i dess relevanta histologiska sammanhang. Men eftersom kromogen signalen genereras av IHC är subtraktiv, det lider av ett relativt smalt dynamik och erbjuder begränsad potential för multiplexing2,3,4. Matrix-assisted laser desorption/jonisering masspektrometri imaging (MALDI-MSI) bevarar morfologiska integritet. Dock denna teknikutveckling är associerad med blygsamma morfologiska upplösning och kräver betydande kalibrering och normalisering, försämra dess genomförbarhet för rutinmässig klinisk användning5,6,7. Alternativa tekniker för att kvantifiera protein i vävnadsprover omfattar immunoblotting8, masspektrometri9,10,11och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, varje av som börjar med en homogeniserad lysate av vävnadsprover. Primära vävnadsprover är heterogena i att de innehåller en mängd celltyper. Därför tillåter tekniker som innebär homogenisering proverna inte kvantifiering av ett protein i en viss cell population av intresse, såsom cancerceller.
Liknar IHC, om är tillämplig på små FFPE prover och tillåter lagring av histologiska integritet13. Men tack vare tillsatsen natur av fluorescens signaler, om är mottagliga för tillämpningen av flera primära antikroppar och fluorescerande etiketter. Således kan ett protein av intresse kvantifieras relativt inom specifika celler eller cellulära fack (exempelvis nucleus kontra cytoplasman) definieras med andra antikroppar. Fluorescens signaler har också fördelen av en större dynamiskt omfång13,14. Den överlägsenhet, reproducerbarhet och multiplexering potential har om tillämpas på FFPE prover visat13,14,15.
Detta dokument beskriver vi användningen av kvantitativa immunoblotting använder etablerade cellinjer som en guld-standard för att fastställa kvantitativa beskaffenhet om tillsammans med datorstödd bildanalys för att fastställa det relativa överflödet av ett protein av intresse i histologiska sektioner från FFPE vävnadsprover. Vi har tillämpat denna metod framgångsrikt i en multiplex strategi att kvantifiera biomarkör proteiner i kliniska biopsi prov16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit en metod som använder kvantitativa immunoblotting (IB) för att påvisa nyttan av immunofluorescens (om) för att fastställa det relativa överflödet av ett målprotein i FFPE vävnadsprover. Nuvarande metoder för kvantifiering av protein är begränsade av sin kategoriska natur, såsom kromogen IHC2,3, eller att behöva homogenisera prover, förhindra utredning prov struktur och cell befolkningen, såsom med IB och masspektrometri<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades delvis av Fredrick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium (A.M.).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
