Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak
Summary
Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.
Abstract
Miktar formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi proteinlerin klinik olarak önemli olduğunu ve araştırma uygulamaları. Miktar bir en iyi yöntem doğrudur, geniş bir doğrusal dinamik alanı vardır ve tek tek hücre tiplerinin tanımlanması için izin vermek için örnek yapısal bütünlüğünü korur. Geçerli yöntemleri immünhistokimya (IHC), kütle spektrometresi ve immunoblotting gibi her kategorik kendi doğası nedeniyle bu hükümleri yerine veya örnek homojenize gerekiyor. Alternatif bir yöntem ayirt (Eğer) ve faiz FFPE dokulara protein göreli bereket belirlemek için görüntü analizi öneriyorum. Burada biz bu yöntemi kolayca optimize edilmiştir, geniş dinamik alan verimleri ve nicel immunoblotting altın standart göre doğrusal olarak ölçülebilir göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem örnek yapısal bütünlüğünü bakım izni ve tanılama uygulamalarda çok önemli olabilir çeşitli hücre tiplerinin düzeye çıkarılmasını sağlar. Genel olarak, bu FFPE örneklerinde proteinlerin göreli miktar için sağlam bir yöntemdir ve klinik uygun veya ihtiyaçları araştırma için kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Proteinler formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku biyopsisi örneklerinde ölçmek için gereken birçok klinik alanda bulunmaktadır. Örneğin, miktar rutin biyopsi örnekleri biyomarker proteinlerin prognoz aydınlatmak ve tedavi kanser hastaları1için bilgilendirmek için kullanılır. Ancak, geçerli yöntemleri genellikle öznel ve doğrulama eksikliği.
İmmünhistokimya (IHC) patoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılan ve genellikle birincil bir antikor hedef protein yönetmen ve horseradish peroksidaz2gibi enzimatik bir etiketi ile Birleşik bir ikincil antikor bağlıdır. Geleneksel IHC duyarlıdır, yapabilirsiniz dakika kullanımı örnekleri ve dolayısıyla protein ifade ile ilgili histolojik bağlamı içinde değerlendirilmesi erişimine izin verme doku örnekleri morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, IHC tarafından oluşturulan chromogenic sinyal Eksiltici olduğundan, nispeten dar Dinamik Aralık uğrar ve2,3,4çoğullama için sınırlı potansiyel sunmaktadır. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (MALDI-MSI) görüntüleme morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, gelişmekte olan bu teknoloji mütevazı morfolojik çözünürlük ile ilişkilidir ve önemli kalibrasyon ve normalleştirme, onun fizibilite rutin klinik kullanım5,6,7için kararlar almanı gerektirir. İmmunoblotting8, kütle spektrometresi9,10,11ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)12, doku örnekleri protein ölçmek için alternatif teknikleri dahil her homojenize ile başladığı, örnek doku lysate. Birincil doku örnekleri türdeş olmayan çok sayıda hücre türleri içerdikleri vardır. Bu nedenle, homojenizasyon örnekleri gerektirecektir teknikleri bir protein miktar kanser hücreleri gibi ilgi belirli hücre nüfus izin vermez.
IHC, olsa gibi küçük ve ilgili FFPE örnekleri ve histolojik bütünlük13tutma izin verir. Ancak, floresan sinyallerini, katkı doğaya teşekkür Eğer birden çok birincil antikorlar ve floresan etiket uygulamaya müsait değil. Böylece, bir protein ilgi nispeten belirli hücreleri veya hücresel kompartmanlarda (örneğin, çekirdek karşı sitoplazma) diğer antikorları kullanılarak tanımlanmış içinde sayısal. Floresan sinyallerini de büyük bir Dinamik Aralık13,14avantajı var. Üstünlük, tekrarlanabilirlik ve çoğullama potansiyelini gösterdiği13,14,15FFPE örnekler için uygulanan olmuştur.
Burada nicel immunoblotting ilgi bir protein göreli bolluk belirlemede bilgisayar destekli görüntü analizi ile birleştiğinde nicel doğası tespit için altın standart olarak kurulan hücre hatları kullanarak nasıl kullanılacağını açıklar FFPE doku örnekleri histolojik bölümlerden. Bu yöntemde biyomarker proteinler klinik biyopsi örnekleri16,17,18ölçmek için çok katmanlı bir yaklaşım başarıyla uygulamış.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir yöntem tarif var nicel immunoblotting (IB) ayirt (Eğer) yardımcı programı göstermek için bir hedef protein FFPE doku örneklerinde göreli bolluk ascertaining için yararlandığına. Geçerli protein miktar yöntemleri chromogenic IHC2,3gibi kategorik doğaları gereği veya örnekleri gibi örnek nüfus yapısı ve hücre içine soruşturma önlenmesi, homojenize gerektiğinden sınırlıdır IB ve kütle spektrometresi8,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Fredrick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu (A.M.) tarafından finanse edildi.
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
