由小圆形 DNA 分子构建的稳定 DNA 分子、一维和二维纳米结构
Summary
本文详细介绍了小圆形 DNA 分子 T4 结扎和变性 PAGE 纯化、圆形瓷砖退火和原生 page 分析、一维和二维 DNA 纳米结构的组装和 AFM 成像以及琼脂糖凝胶的研究。有限 DNA 纳米结构的电泳和离心纯化。
Abstract
本文详细介绍了小圆形 DNA 分子的合成、圆形 DNA 图案的退火以及一维和二维 DNA 纳米结构的构建。几十年来, DNA 纳米技术的快速发展归功于线性 Dna 的使用作为源材料。例如, DAO (双交叉、反平行、奇数半转) 磁贴作为构建 2D DNA 格子的构建块而闻名;DAO 的核心结构是由两个线性单链 (ss) 寡核苷酸组成的, 就像两条绳子做右手老奶奶结一样。在这里, 一种名为 cDAO (耦合 DAO) 的新型 DNA 切片是使用 cDAO 或 cDAO (圆形64或84核苷酸) 的小圆形 ss-DNA 作为支架链和几个线性 Ss-dna 作为主要链。完美的一维和二维纳米结构由 cDAO 瓷砖组装而成: 无限纳米线、纳米轴、纳米管、纳米带;和有限的纳米矩形。详细的方案描述: 1) T4 连接酶制备和纯化变性 page (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 的小圆形寡核苷酸, 2) 退火稳定的圆形瓷砖, 其次是本地 PAGE 分析, 3) 组装无限一维纳米线、纳米轴、纳米轴、纳米管和纳米带的无限二维晶格和有限二维纳米矩形, 然后是原子力显微镜成像。该方法简单、可靠, 对大多数实验室来说都是经济实惠的。
Introduction
DNA 分子已被用于建立多种纳米结构几十年来。典型的图案包括 dae (双交叉, 反平行, 甚至半转) 和 dao瓷砖 1,2, 3, 星牌 4,5,6, 7, 单链 (ss)瓷砖 8,9,10和 dna 折纸11,12,13。这些 DNA 图案和格子是由线性 ss-DNAs 组装而成的。最近, 我们还报告了使用圆形 ss-寡核苷酸作为支架来构建图案、一维纳米管和二维格子14、15、16、17。通过在 c64nt 中心插入 holliday 连接点 18、19、20、21,可以形成一对两个耦合 dao 磁贴17。这个新的 cDAO 母题及其衍生物足够稳定和刚性, 可以组装高达 3×5μm 2 的二维 DNA晶格。在本文中, 我们使用了一个术语 “圆形瓷砖”, 它被定义为一个稳定的 DNA 复杂分子, 用一个圆形支架和其他线性的 ss-寡核苷酸的钉建造, 另一个术语 “线性瓦”, 它是由一个完整的线性生成寡核苷酸。
该协议演示了如何构建五种 DNA 纳米结构, 这些纳米结构以小圆形 dna 分子为支架: 1) 无限一维 c64nt 和 c64nt 纳米线, 2) 无限二维 Cdao-c64nt-o 和 Cdao-c64t-e (-o 代表5个半圈和—表示偶数的4个半转) 格子, 3) 无限二维 cdao-c8nt-o 和 Cdaa-c84nt e 晶格, 4) 有限的 2D 5×6 Cdao-c64n-o 和 5×6 cdao-c74&84nt o 矩形, 5) 无限 1D acdaa-c4nt e 纳米颗粒和纳米轴 (请参阅 图 3-5用于上述五种 dna 纳米结构的示意图和图像)。一维 c64nt 和 c64nt 纳米线分别从与两个线性订书机相关的每个 c64nt 和 c64nt 支架中组装而成。Cdao-c64nt、Acda-c64nt、cdaa-c74nt 或 Cdao-c84nt 的每个圆形磁贴分别从其相应的 c64nt、c74nt 或 c84 nt 的脚手架中退火, 并分别使用四个线性订书针进行退火。无限二维格子是从具有不同序列的两个圆形磁贴的同一类型进行组装的。两个有限的二维矩形格子分别从32块圆形子网格的两组组合在一起。为了省钱, 在第一个亚退火步骤中, 分别使用不同的悬架来退火32°o-c64nt、12个 cdaa-c74 和 20个 cdao-c84nt 圆形分瓦, 而不同的悬架则只使用单级 c64nt、c64nt 和 c64nt 作为相应的脚手架将相应的32个圆形子晶瓦混合在一起, 应用第二晶格退火步骤分别组装有限的 5×6 cdao-c64n-o 和 5×6 cdao-c74&84nt-o 晶格。当然, 不同顺序的圆形支架可以用来组装各种有限尺寸的纳米结构, 但它将花费更多的金钱和劳动力。无限 1D Acdaa-c64nt e 纳米颗粒和纳米光谱是由一个序列的非对称 acda-c64t 磁贴退火, 线性连接数均匀, 为4个半圈。有两种方法可以从 Cdao-c64nt 和 Cdao-c84nt 的圆形磁贴中组装无限二维格子, 它们分别由偶数4和5个半圈的奇数的互距来区分。前者要求所有磁贴以相同的方式对齐;后者要求沿螺旋轴交替相邻的两个瓦片的面。如果磁贴是刚性和平面的, 例如 Cdao-c64nt, 这两种方法都会产生平面纳米带;如果磁贴向一个方向弯曲, 例如 Cdao-c84nt, 偶数4半转的互连将产生纳米管, 而奇数5半转的互连将产生平面纳米带, 因为消除了曲线偏置的增长, 通过弯曲的瓷砖的交替对齐。从圆形瓷砖成功组装一维和二维 DNA 纳米结构表明了这种新方法的几个优点: 圆形瓷砖的强制稳定性和刚性, 而不是线性瓷砖, 手性瓷砖用于组装非对称纳米结构, 如纳米颗粒和纳米带, 了解 DNA 力学和分子结构等的新愿景。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提出的方案主要集中在小圆形 DNA 分子的合成和 DNA 纳米结构的组装上。大多数随机测序的 DNA 设计可以在该协议中使用。圆形 Dna 的纯度对于 DNA 组件的成功至关重要。降低 5 ‘-磷酸化线性 DNA 的浓度可以提高环化的生产产率;但是, 这将增加产生相同数量的循环 Dna 的工作量。夹板 DNA 链的长度也会影响正确的结扎反应, 优化后 c64nt 和 c64nt 的核苷酸长度在20个左右。
在组装?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢国家自然科学基金 (91753134 和 21571100) 和东南大学生物电子国家重点实验室的财政支持。
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
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