Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut
Summary
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für T4 Ligatur und Geruchsstoffen Seite Reinigung der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, Glühen und native Seitenanalyse der kreisförmigen Platten, Montage und AFM Imaging von 1D und 2D DNA Nanostrukturen sowie Agarose-gel Elektrophorese und Zentrifugation Reinigung des endlichen DNA Nanostrukturen.
Abstract
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Synthese der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, kreisförmige DNA-Motive und Bau von 1D und 2D DNA Nanostrukturen glühen. Über Jahrzehnte ist die rasante Entwicklung der DNA-Nanotechnologie zur Verwendung von linearen DNA als die Ausgangsstoffe zurückzuführen. Beispielsweise ist die DAO (double Crossover, antiparallel, ungerade halbe Umdrehungen) Fliese bekannt als ein Baustein für den Bau der 2D DNA Gitter; die Kernstruktur des DAO besteht aus zwei lineare einzelsträngige (ss)-Oligonukleotide, wie zwei Seile machen einen rechten Oma Knoten. Hier werden eine neue Art von DNA-Fliesen genannt cDAO (gekoppelte DAO) mit einen kleinen kreisförmigen ss-DNA von c64nt oder c84nt gebaut (Rundschreiben 64 oder 84 Nukleotide) als Gerüst-Strand und mehrere lineare ss-DNA als Grundnahrungsmittel Stränge. Perfekte 1D und 2D Nanostrukturen aus cDAO Fliesen zusammengesetzt sind: unendliche Nanodrähte, Nanospirals, Nanoröhren, Nanoribbons; und endlichen Nano-Rechtecke. Ausführliche Protokolle werden beschrieben: (1) Vorbereitung von T4-Ligase und Reinigung durch Denaturierung (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) Seite der kleinen kreisförmigen Oligonukleotide, 2) Glühen von stabilen kreisförmigen Platten, gefolgt von native Seitenanalyse, (3) Montage der unendliche 1D Nanodrähte, Nanoringe, Nanospirals, unendliche 2D Gitter von Nanoröhren und Nanoribbons und endlichen 2D Nano-Rechtecke, gefolgt von AFM (Atomic Force Microscopy) Bildgebung. Die Methode ist einfach, robust und erschwinglich für die meisten Labore.
Introduction
DNA-Moleküle wurden verwendet, um viele Arten von Nanostrukturen über Jahrzehnte zu bauen. Typische Motive sind DAE (doppelte Crossover, antiparallel, noch halb-Umdrehungen) und DAO Fliesen1,2,3, Sterne Fliesen4,5,6,7, Einzelbett gestrandet (ss) Fliesen8,9,10und DNA Origami11,12,13. Diese DNA-Motive und Gitter sind aus linearen ss-DNAs zusammengesetzt. Vor kurzem berichteten andere und wir die Verwendung von kreisförmigen ss-Oligonukleotide als Gerüste, Motive, Nanoröhren 1D und 2D Gitter14,15,16,17zu bauen. Durch das Einfügen einer Holliday Junction (HJ)18,19,20,21 in der Mitte des c64nt, kann ein paar von zwei gekoppelten DAO Kacheln gebildeten17sein. Dieses neue cDAO Motiv und seine Derivate sind stabil und steif genug, um 2D montieren Salzgitter DNA bis zu 3 × 5 µm2. In diesem Papier verwenden wir eine Laufzeit von “kreisförmige Fliese”, definiert als eine stabile komplexe DNA-Molekül mit einem kreisförmigen Gerüst und andere lineare Grundnahrungsmittel der ss-Oligonukleotide gebaut und ein weiterer Begriff “lineare Fliese”, die aus einem vollständigen Satz von linear aufgebaut ist SS-Oligonukleotide.
Dieses Protokoll zeigt, wie Sie fünf Arten von DNA Nanostrukturen mit kleinen kreisförmigen DNA-Molekülen als Gerüste zu konstruieren: 1) unendliche 1D c64nt und c84nt-Nanodrähte, 2) unendliche 2D cDAO-c64nt-O und cDAO-c64nt-E (-O steht für eine ungerade Anzahl von 5 halbe Drehungen und -E entspricht einer geraden Anzahl von 4 halbe Drehungen) Gittern, 3) unendliche 2D cDAO-c84nt-O und cDAO-e c84nt Gitter, 4) endlichen 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O Rechtecke, 5) unendlich 1 D AcDAO-c64nt-E Nanoringe und Nanospirals (siehe Abbildung 3-5 für die schematische Zeichnungen und Bilder der oben genannten fünf Arten von DNA Nanostrukturen). Die 1D c64nt und c84nt-Nanodrähte werden aus jeder c64nt und c84nt Gerüst mit zwei linearen Heftklammern verbunden bzw. montiert. Jede Runde Kachel cDAO-c64nt, AcDAO-c64nt, cDAO-c74nt oder cDAO-c84nt ist von seiner entsprechenden Gerüst von c64nt, c74nt oder c84nt mit vier lineare Heftklammern bzw. geglüht. Die unendliche 2D Gitter sind aus dem gleichen Typ von zwei kreisförmigen Platten mit verschiedenen Sequenzen montiert. Die zwei endliche 2D Rechteck-Gitter werden jeweils aus zwei Sätzen von 32 Runden Sub-Platten montiert. Um Geld zu sparen, nur ein sequenziert c64nt, c74nt und c84nt dient als das jeweilige Gerüst während verschiedenen Überhängen verwendet werden, um die 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt und 20 cDAO-c84nt kreisförmigen Sub-Platten bzw. im ersten Sub Fliese Glühen Schritt, dann glühen Mischen Sie die entsprechenden 32 kreisförmigen Sub-Platten zusammen und auftragen Sie das zweite Gitter Glühen Schritt um die endlichen 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O-Gittern, bzw. zu montieren. Auf jeden Fall, können anders sequenziert kreisförmige Gerüste zur Montage einer Vielzahl von endlicher Größe Nanostrukturen, verabschiedet, doch es mehr Geld und Arbeit kostet. Die unendliche 1D AcDAO-c64nt-E Nanoringe und Nanospirals sind aus einer sequenziert asymmetrische AcDAO-c64nt-Fliesen mit lineare Verbindungen von einer geraden Anzahl von 4 halbe Drehungen geglüht. Es gibt zwei Ansätze zum unendlichen 2D Gitter aus kreisförmigen Platten cDAO-c64nt und cDAO-c84nt, die sich durch die intertile Entfernungen von einer geraden Anzahl von 4 und eine ungerade Anzahl von 5 halbe Umdrehungen bzw. montieren. Ersteres erfordert alle Fliesen gleich ausgerichtet werden; Letzteres erfordert Wechsel von den Gesichtern der beiden benachbarten Fliesen entlang der spiralförmigen Achsen. Wenn die Fliese starr und planar, z. B. cDAO-c64nt ist, werden beide Ansätze planaren Nanoribbons erzeugen; Wenn die Fliesen in eine Richtung, wie z. B. cDAO-c84nt, die intertile Verbindung aus einer geraden Anzahl von 4 gekrümmt ist halbe Umdrehungen generiert Nanoröhren, während die intertile Verbindung aus einer ungeraden Zahl von 5 halbe Umdrehungen erzeugt planaren Nanoribbons durch Wegfall der Krümmung voreingenommen Wachstum durch alternative Ausrichtung der gebogene Fliesen. Die erfolgreiche Montage von 1D und 2D DNA Nanostrukturen aus kreisförmigen Platten zeigt mehrere Vorteile dieses neuen Ansatzes: Stabilität und Steifigkeit der kreisförmigen Platten über lineare Fliesen, chiralen Fliesen für die Montage von asymmetrischen Nanostrukturen wie erzwungen Nanoringe und Nanoribbons, neue Visionen auf die DNA-Mechanik und molekularen Strukturen, etc.zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Protokolle, die in diesem Artikel konzentrieren sich auf die Synthese der kleine kreisförmige DNA-Moleküle und die Montage von DNA Nanostrukturen vorgestellt. In diesem Protokoll können die meisten zufällig sequenzierten DNA-Designs verwendet werden. Die Reinheit der kreisförmigen DNAs ist entscheidend für den Erfolg von DNA-Baugruppen. Die Produktionsausbeute des Biosyntheseschritt kann durch Senkung der Konzentration von 5′ phosphoryliert lineare DNA verbessert werden; Dies erhöht jedoch die Arbeitsauslastun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für finanzielle Unterstützung von der NSFC (Zuschüsse Nr. 91753134 und 21571100) und den Schlüssel Labor der Bioelektronik von Südosten Landesuniversität.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
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