Vi introducerar ett nytt arbetsflöde för elektronmikroskopi utredningar av hjärnvävnad. Metoden tillåter användaren att undersöka neuronala funktioner på ett opartiskt sätt. För elementaranalys presenterar vi också ett skript som automatisk de flesta av arbetsflödet för randomiserade provtagning.
Utredningar av de ultrastrukturella funktionerna av nervceller och deras synapser är endast möjligt med elektronmikroskopi. Speciellt för jämförande studier av förändringar i densiteter och fördelningar av sådana funktioner är en opartisk provtagning-protokollet avgörande betydelse för tillförlitliga resultat. Här presenterar vi ett arbetsflöde för bild förvärv av hjärnan prover. Arbetsflödet kan systematisk enhetliga slumpmässig provtagning inom en definierad hjärnregionen, och bilderna kan analyseras med hjälp en disector. Denna teknik är mycket snabbare än omfattande undersökning av seriell avsnitt men fortfarande utgör en genomförbar strategi för att uppskatta de tätheter och fördelningar av ultrastruktur funktioner. Innan inbäddning användes färgade vibratome sektioner som referens för att identifiera hjärnregionen under utredning, som hjälpte påskynda den övergripande prov förberedelsen bearbeta. Denna metod användes för jämförande studier som undersöker effekten av en berikad-Boende miljö på flera ultrastrukturella parametrar i mus hjärnan. Baserat på den framgångsrika användningen av arbetsflödet, anpassade vi den för elementaranalys av hjärnan prover. Vi har optimerat protokollet när det gäller tidpunkten för användar-interaktion. Automatisera alla tidskrävande steg genom att sammanställa ett skript för öppen källkod SerialEM hjälper användaren att fokusera på det huvudsakliga arbetet att förvärva elementärt kartor. Liksom i det ursprungliga arbetsflödet uppmärksammade vi den opartiska urvalsmetod innebär att garantera tillförlitliga resultat.
I elektronmikroskopi är det ofta utmanande att prova representativa regioner inom avsnitten. Vi, är som observatör ofta vinklade för att titta på specifika regioner dras till vår uppmärksamhet av iögonfallande funktioner av provet, hindrar en väl fördelad, opartisk provtagning. Provtagning bias kan endast undvikas om varje del av regionen av intresse får samma chans att hamna i en elektron mikrograf1. Det är möjligt att undvika provtagning partiskhet utan en programvarulösning, till exempel genom att trycka trackball av mikroskopet manuellt utan att titta på bilden, så välj provtagning regioner där scenen slutar. Men strängt taget, detta är inte ett slumpmässigt förfarande, eftersom, medvetet eller omedvetet, användaren kan påverka rörelsen av scenen, och, dessutom, detta är inte ett sofistikerat sätt att välja provtagning regioner. Slumpmässig provtagning blir särskilt viktigt om par sektioner används för att bedöma antalet strukturer i en viss volym, till exempel för stereology1, vilket kräver par sektioner, en känd sträcka apart. Det skulle också vara möjligt att bara titta på ett avsnitt och uppskatta antalet specifika strukturer2, men med detta synsätt utredare tenderar att överskatta den numeriska tätheten av större strukturer, om strukturer är mycket små i jämförelse till snittjockleken. Alternativa metoder är att rekonstruera volymer av vävnad från seriell sektioner och därmed få önskad data3. Men detta är mycket tidskrävande och inte en genomförbar strategi för (större) jämförande studier.
För att övervinna dessa problem, har vi utvecklat ett arbetsflöde som tillåter forskare att automatiskt välja prov för att erhålla elektronmikrografier på regelbundna avstånd inom ultratunn sektioner. Placera av elektronmikrografier är slumpmässig, så att opartisk provtagning. Metoden är lämplig både för att fastställa numeriska tätheter av strukturer (till exempel synapser inom en viss neuropil volym4,5) och måtten på strukturella funktioner (exempelvis bredden på den synaptiska spalten, (eller diametern på den postsynaptiska density4,5).
Arbetsflödet använder en skräddarsydd slumpmässig punkt provtagning (RPS) programvara (skriven i Java-skript som använder skript programvara medföljer våra Mikroskop) som automatiskt beräknar rutnät ståndpunkter inom ett fördefinierat område av intresse i en ultratunn avsnitt. RPS programvaran flyttar scenen av elektronmikroskopet till dessa fördefinierade punkter, så att en elektron mikrograf kan göras vid varje punkt. Användaren definierar först, en region av intresse inom avsnittet tunn. Därefter beräknar RPS programvaran rutnät ståndpunkter inom denna region. X / y-koordinaterna för den första positionen skapas slumpmässigt, och de resterande positionerna placeras regelbundet rutnät mellanrum i avseende till den första positionen. Eftersom varje del av regionen av intresse har samma chans att granskas, tillåter detta minimal datainsamling. Denna strategi för provtagning också kallas systematisk enhetliga stickprov (se referenser6,7 för mer detaljer).
För att fastställa den numeriska täthet av strukturer, arbetar vi med par av sektioner som är en känd sträcka apart. Efter att få en elektron mikrograf från det första avsnittet i en av de förutbestämda positionerna, flyttar TEM seriell avsnitt programvara (ingår i programpaketet medföljer våra elektronmikroskop) till motsvarande punkt i det andra avsnittet, för att få en elektron mikrograf av motsvarande plats. Detta upprepas för varje plats i rutnätet förutbestämd. I vår strategi används en disector att räkna antalet partiklar i varje par elektronmikrografier8,9. En disector består av ett par counting bågar, en för varje avsnitt8,9. Numeriska tätheten av objekt bestäms genom att bara räkna objekt synliga på första avsnittet (eller referensavsnitt) men inte på andra avsnittet (eller uppslag avsnitt). Detta tillåter för att uppskatta den numeriska täthet av objekt i en snabbt och effektivt sätt8,9. Dessutom på enstaka sektioner, kan tvådimensionell strukturella egenskaper mätas.
Vi har tillämpat detta arbetsflöde framgångsrikt för att bedöma skillnader i synapsen numrerar i hippocampus av möss som utsätts för syreberikad miljö (EE) boendeförhållanden jämfört med standard miljö (SE) bostäder villkor4,5, och även att utvärdera ultrastrukturella skillnaderna mellan vildtyp (WT) möss och neuropeptid Y (NPY) KO möss hålls under SE och EE5. Vårt mål var att titta specifikt på strukturella funktioner av nervceller, såsom numeriska synaptisk densitet, längderna av den aktiva zonen i tvärsnitt och postsynaptiska tätheten, bredden på den synaptiska spalten, och antalet synaptic vesicles, för att bedöma förändringar i neuronala connectivity och aktivering mellan de olika experimentella villkor. Dessutom var vi intresserade av numeriska tätheten av tät-core blåsor (DCV) i nervceller att bestämma mängden lagrade neuropeptider i ett visst hjärnområde.
Baserat på framgången för vår strategi för de studier som beskrivs ovan, på vårt nästa steg, har vi anpassat vårt arbetsflöde för att välja områden för opartisk elementära analyser inom mänskliga hjärnan prover. Detta gjordes till bild järn, som lagras i ferritin molekyler i både neuron och gliaceller. För detta sammanställt vi ett skript som tillät oss att automatisera de flesta åtgärder för en slumpmässig screening process av hjärnan delar i ett avgränsat område.
Det arbetsflöde som presenteras här kan forskaren få data på ultrastrukturella funktioner på ett opartiskt sätt. Detta är mycket mindre tidskrävande än volym utredningar från seriell avsnitt. Flera olika program används för att uppnå detta mål. Först används vår skräddarsydda RPS -programvara (för information om tillgänglighet, vänligen kontakta motsvarande författare) för att införa en slumpmässig scenen-shift för att välja provtagnings området koordinaterna. Detta tillåter en systematisk enhetliga stickprov av ROI. Nästa, för räkning av särskilda strukturer, vi anpassade den disector metoden, där 2 på varandra följande sektioner med känd distans jämförs, på ett nytt sätt jämfört med tidigare studier13,14,15 som vi använde våra skräddarsydda RPS programvara för systematisk enhetliga stickprov. Detta sparar tid jämfört med 3D-rekonstruera hela volymer från seriell avsnitt. Skräddarsydda RPS programvaran är speciellt utvecklat för en typ av Mikroskop som är en begränsande faktor för återgivning av arbetsflödet. Ett alternativ från denna specifika programvara skulle vara ett program som tillåter skriptkörning och är kompatibel med andra Mikroskop modeller.
Vi har framgångsrikt använt denna metod för vår jämförande studier4,5. På ultra-tunn sektioner av neuronal vävnad, området av intresse skissades och bilder togs av systematisk enhetliga stickprov inom detta område. Det måste noteras att området av intresse, polymorph lagret av dentate gyrus, är ett ganska litet område att undersöka vilket kan vara fördelaktigt för vår strategi. Inom ett slumpmässigt placerade disector, vi utvärderat antalet DCV och flera ultrastrukturella funktioner av synapser i DGpl av vuxna möss inrymt i SE och EE samt vuxen WT möss kontra vuxna NPY knockoutmöss. Insamlade data med våra förhållningssätt, och visade förändringar i några av de undersökta parametrarna. Fynden bekräftade de från andra liknande studier på unga djur2.
En nackdel med den experimentella användningen av detta arbetsflöde kan vara att denna multi-application-strategi inte är perfekt när det gäller användarvänlighet, eftersom användarna måste få bekväm med olika användargränssnitt (i vårt fall, användargränssnittet, TEM seriell avsnitt RPS programvaran och SerialEM programvara). Lära sig att hantera alla ansökningar på ett effektivt sätt är tidskrävande och bör beaktas. Investera tid i att lära sig att använda det här arbetsflödet är dock fortfarande klart gynnsamt under den tid som behövs för att analysera hela volymer med seriell avsnitt TEM. Metoden att använda en disector som placeras genom systematisk enhetliga stickprov i området av intresse är tillräckligt att presentera tillförlitlig data1 utan att behöva undersöka en hög mängd sektioner/volym.
För att maximera resultatet i våra studier, var det viktigt att ta god vård under Provberedning, som bevarandet av vävnaden och strukturer inte är bara avgörande för att utvärdera strukturella funktioner, men också för att identifiera det intresse otvetydigt. En avgörande faktor, och kanske en annan nackdel med denna metod, är att det krävs en hög kvalitet på ultra tunna snitt par: det måste finnas några hål eller rynkor som täcker området under utredning i någon av punkterna och snittjockleken måste vara underhålls homogen. Forskaren måste vara välutbildade i ultramicrotomy. Vård har också vidtas när imaging avsnitten i TEM, eftersom avsnitten är känsliga för electron beam skador och kan enkelt riva isär. Dessutom är det viktigt att välja rätt antal provtagning områden i ROI. Beroende på syftet experimentella måste förstoringen av elektronmikrografier ställas in noggrant. För våra experiment specifikt är räknar synapser i centrala nervsystemet, 20 regioner av intresse på ett avsnitt med området av 30.25 µm2 optimal. Det rekommenderas att utbilda personal väl i erkänner funktionerna som är i fråga (i vårt fall synapser, synaptic funktioner och DCV) att få tillförlitliga resultat. För att identifiera synapser, de synaptiska vesikler måste vara identifierbar och detta kräver en upplösning på minst 10 nm. För detta, en förstoring på 5000 X var optimal, men det måste noteras att förstoringen beror på hårdvara parametrar såsom typ och position av kameror och skulle behöva anpassas för andra Mikroskop eller kamera typer. Det måste också noteras att protokollet använder program som är specifika för en TEM och att användare med andra modeller har att beakta skillnaderna i installationen.
Vi tror att vårt arbetsflöde kan anpassas för många andra tillämpningar inte bara i neurovetenskap men i ett brett fält av biologisk vetenskap och även materialvetenskap (när den höga upplösningen av en TEM behövs) närhelst forskningsfrågan kräver en systematisk uniform stickprov och antalet prover som skall undersökas frågar efter en tid effektivt sätt för analys. Vi är till exempel för närvarande intresserade lokalisera järnförråd i den mänskliga hjärnan. För detta har vi nyligen anpassat vårt arbetsflöde, om du vill aktivera elementaranalys på ultra-tunn sektioner i slumpvis utvalda områden. För att minimera antalet program som behövs för arbetsflödet, syftar vi till att tillämpas med hjälp av SerialEM-programvara bara, eftersom den kan programmeras att flytta scenen till förutbestämda punkter som kan väljas på ett slumpmässigt sätt. Vi skapade anpassade skript för att styra TEM, med målet att automatizing arbetsflödet helt. Detta visade sig vara genomförbart utom autofokus i filtrerade imaging läge, vilket inte ger tillfredsställande resultat. Vi använde därmed DM programvara för fokusering och för att få energi-filtrerad bilder.
Sammanfattningsvis presentera vi lösningar som hjälper att få elektronmikrografier på ett opartiskt sätt.
The authors have nothing to disclose.
Finansieras av det österrikiska Science fond, FWF, projektnumret P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |