À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

Résumé

Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.

Résumé

Inspiré par le mythe de cheval Troie Homer´s, nous avons conçu le pathogène maïs Ustilago maydis pour fournir des protéines sécrétées dans l’apoplaste maïs permettant une analyse phénotypique in vivo. Cette méthode ne s’appuie pas sur la transformation de maïs, mais exploite la génétique microbienne et des capacités sécrétoires des agents pathogènes. Il permet aux présentes, inspection in vivo livré des protéines sécrétées à haute résolution spatio-temporelle à différents types de tissus et de sites d’infection. La stratégie du cheval de Troie peut être utilisée en complément transitoirement maïs phénotypes de perte de fonction, afin de caractériser sur le plan fonctionnel des domaines protéiques, pour analyser les effets de la protéine hors cible, ou d’étudier un surdosage onside protéine, ce qui en fait un outil puissant études de protéine dans le système de récolte de maïs. Cet ouvrage contient un protocole précis sur la façon de générer une souche de cheval de Troie suivie de protocoles normalisés de l’infection à appliquer cette méthode à trois types de différents tissus de maïs.

Introduction

Le pathogène biotrophe Ustilago maydis est l’agent causal du maïs charbon maladie¹. Il infecte tous les parties aériennes de maïs ayant pour résultat les grosses tumeurs qui renferment des spores mélanisées, noir. Au niveau mondial, U. maydis est estime susceptible de causer une perte annuelle d’environ 2 % du rendement du maïs, tandis que les tumeurs sont appréciés comme un délice gastronomique au Mexique. Infection des plantes est initiée par un appressorium qui sécrète des enzymes lyse de la paroi cellulaire pour pénétrer dans la première couche de cellules épidermiques de maïs. Partir d’un site d’infection primaire, U.....

Protocole

1. construction d’un cheval de Troie maydis U.

Remarque : Voir la Figure 1.

1. Amplifier un gène d’intérêt de maïs cDNA utilisant des amorces spécifiques de gènes et une relecture ADN polymérase. Cloner le principal produit PCR et transformer la construction de e. coli en suivant les instructions du fournisseur plasmide. Vérifiez le gène correct de la séquence d’intérêt par avant séquençage Sanger à utiliser pour les prochaines étapes de clonage.
   Remarque : Spécifications de PCR doivent être optimisées en raison des amorces séquence spécific....

Résultats

Des constructions pour des expériences de cheval de Troie U. maydis sont clonées dans le plasmide p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-gène d’intérêt-mCherry-Ha. Le maïs gène d’intérêt est fusionné à un journaliste de fluorescence mCherry et un épitope HA-tag. L’expression de la protéine de fusion est sous contrôle du promoteurpit2 U. maydis mu qui est spécifiquement acti.......

Discussion

Recherche sur les cultures modernes exige des protocoles pour l’analyse moléculaire sur la génétique et des niveaux de protéine. L’accessibilité génétique par transformation n’est pas disponible ou inefficaces et fastidieuse pour la plupart des espèces de cultures telles que le maïs. En outre, des outils génétiques fiables tels que les systèmes de journaliste promoteur sont rares, ce qui rend difficile d’étudier la fonction des protéines in situ avec une haute résolution spatio-temporelle à sites tissulaires dis.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 2 ml  ;	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 aiguille hypodermique	B. Braun	4657640
Bacto Peptone  ;	BD	211677
ADNc du maïs			du tissu de maïs exprimant le gène de l’intervalle
Charbon de bois	Sigma-Aldrich	05105
Microscope			Utilisation de l’équipement disponible localement
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubateur-agitateur réglé à 28 ° ; C, 200 tr/min			utiliser l’équipement disponible localement
Microscope optique avec grossissement			Utiliser l’équipement disponible localement
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			veuillez contacter l’auteur correspondant  ;
Pipette Pasteur (verre, pointe longue)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	peut être remplacée par d’autres vecteurs de clonage de base comme pENTR ou pJET
Potato Dextrose Agar  ;	VWR	90000-745
Sharpie pen			Utilisation d’un équipement disponible localement
d’un	spectrophotomètre
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
em>Xba I	NEB	R0145
Extrait de levure  ;	BD	212750

confocal à balayage laser de 400x Utilisation <