Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode simple et reproductible pour effectuer un test de la phagocytose. La première partie de cette méthode consiste à construire un vecteur animal-SUMO-EGFP (SUMO = petite ubiquitin-comme modificateur) et exprimant accrue de protéine de fluorescence verte (EGFP) chez Escherichia coli (BL21DE). Exprimant EGFP e. coli est co-incubée avec macrophages pendant 1 h à 37 ° C ; le groupe témoin négatif est incubé sur glace pendant le même laps de temps. Ensuite, les macrophages sont prêts pour évaluation. Les avantages de cette technique sont ses étapes simples et clairs, et phagocytose peut être mesurée par les deux flux cytomètre et fluorescence microscope. Les e. coli exprimant EGFP sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte même après que les macrophages sont fixés avec du paraformaldéhyde. Cette méthode est non seulement approprié pour l’évaluation de lignées de cellules macrophages ou macrophages primaires in vitro mais convient également pour l’évaluation des granulocytes et macrophages phagocytose dans les cellules mononucléaires de sang périphérique. Les résultats montrent que la capacité phagocytaire des macrophages péritonéaux de jeunes souris (huit semaines) est supérieure à celui des macrophages de souris âgées de (16 mois). En résumé, cette méthode mesure phagocytose du macrophage et est adaptée pour l’étude de la fonction du système immunitaire inné.

Introduction

Tests de phagocytose des macrophages sont souvent utilisés pour étudier le système immunitaire inné. La réponse immunitaire innée peut indiquer la susceptibilité à l’infection. Lignées de cellules macrophages sont largement utilisées dans les études d’immunologie. Toutefois, le passage prolongé peut causer la perte de gènes et compromis les fonctions immunitaires dans ces lignées de cellules. Ainsi, les macrophages péritonéaux primaires font l’objet idéal permettant d’étudier la fonction des cellules¹.

Bien que la réponse immunitaire innée pensait être intacte dans le corps âgé, la capacité phagocytaire peut diminuer....

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvées par le Comité emploi de Dalian Medical University et animalier. Seize mois (avec un poids de 30-35 g) et huit semaines (20-25 g) SPF (spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes) C57BL/6 des souris mâles ont été obtenues du centre animaux SPF de l’université médicale de Dalian. Toutes les souris étaient gardés dans la stabulation avec accès à la nourriture et l’eau ad libitum. La température a été maintenue entre 20 et 24 ° C, l’humidité était de 40 % - 70 %, et l’....

Résultats

Le vecteur de pET-SUMO utilise un modificateur d’ubiquitin-comme petit pour permettre l’expression des protéines natives dans le e. coli. Fusion de SUMO peut considérablement améliorer la solubilité EGFP, lui permettant d’être détecté facilement. Si l’expression EGFP est induite avec succès en lactose, vous peuvent observer des colonies vertes dans l’obscurité (Figure 1 a). Les points verts, qui représentent l' exprimant EGFP e. coli, peuven.......

Discussion

Les étapes décrites dans le présent protocole sont assez simples et clairs. Une des étapes essentielles est d’induire l’expression EGFP sur e. coli. Habituellement, lorsqu’un gène d’eucaryotes, comme EGFP, est prévu d’exprimer chez les procaryotes comme e. coli, il y a un risque que la protéine se forment des agrégats inactifs (corps d’inclusion), qui modifie la structure native et l’activité de la protéine. En utilisant le vecteur animal-SUMO et construire le plasmide de pET-SUMO-EGFP, la protéine de f.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD FACSCanto II Cytomètre en flux	BD Biosciences-Biotine
anti-souris CD16/32 Anticorps Biolegend		Cat101303
Champion pET SUMO Système d’expression de la protéine	Invitrogen	K300-01
Service de synthèse de gènes personnalisé	Takara Biotech.	-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)	ThermoFisher	D1306
F4/80-PE Anticorps anti-souris pour FACS	Biolegend	Cat123110
Leica DMI3000 B  ; Microscope inversé	Leica	Microsystems-PE
Rat IgG2a, &kappa ;-contrôle des isotypes	Biolegend	Cat400507
Phalloidin 633 solution de travail conjuguée à colorant de fluorescence	AAT Bioquest	Cat23125
Thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	T9032