Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.
Abstract
Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs) der kanonischen TRP Unterfamilie sind obstructions kationen-Kanäle, die eine wichtige im Kalzium-Homöostase, insbesondere Shop betrieben Kalzium-Eintrag, ist entscheidend Rolle für die einwandfreie Funktion der Aufrechterhaltung synaptischen Vesikel Release und intrazellulären Signalwege. Dementsprechend waren TRPC Kanäle in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Störungen wie Herzhypertrophie, neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit und neurologische Störungen wie Spinozerebellare Ataxie verwickelt. Deshalb sind TRPC Kanäle ein potenzielles pharmakologische Ziel bei menschlichen Erkrankungen. Die molekularen Mechanismen der Anspritzung in diesen Kanälen sind jedoch noch unklar. Die Schwierigkeit bei der Beschaffung von großen Mengen an stabile, homogene und gereinigtes Protein wurde ein limitierender Faktor in Struktur Entschlossenheit Studien, insbesondere bei Säugetieren Membranproteine wie die TRPC Ionenkanäle. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den großen Ausdruck von Säugetieren Ionen-Kanal Membranproteinen Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie eine modifizierte Baculovirus-gen-Transfer-System und die Reinigung dieser Proteine durch. Weiter präsentieren wir ein Protokoll, Single-Teilchen Cryo-Elektron Mikroskopie Bilder von gereinigtes Protein zu sammeln und diese Bilder zu verwenden, um die Proteinstruktur zu bestimmen. Strukturaufklärung ist eine leistungsfähige Methode für das Verständnis der Mechanismen der gating und Funktion im Ionenkanäle.
Introduction
Kalzium ist in die zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung Kaskaden, Transkription Kontrolle, Neurotransmitter-Freisetzung und Hormon-Molekül Synthese1,2,3beteiligt. Die homöostatische Wartung der cytosolischen freie Kalzium ist entscheidend für die Gesundheit und Funktion der Zellen. Einer der wichtigsten Mechanismen der intrazellulären Calcium-Homöostase ist Store betrieben Kalzium Eintrag (SOCE), ein Prozess, in dem gespeichert Erschöpfung des Kalziums in das endoplasmatische Retikulum (ER) löst die Öffnung von Ionenkanälen auf der Plasmamembran zu erleichtern, die Auffüllung der ER Kalzium, die dann in weiteren Signalisierung4,5,6verwendet werden kann. Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs), die Kalzium-durchlässige Kanäle, die TRP-Superfamilie angehören, wurden als einer der wichtigsten Teilnehmer SOCE7,8,9 identifiziert.
Unter den sieben Mitgliedern der Familie TRPC TRPC3, TRPC6 und TRPC7 bilden eine Untergruppe homolog, und sie sind einzigartig in der Fähigkeit von Lipid sekundäre Messenger Diacylglycerol (DAG), ein Abbauprodukt von Signalisierung Lipid aktiviert werden Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 drückt sich hoch, in glatten Muskulatur und in der zerebralen und zerebelläre Regionen des Gehirns, wo er entscheidende Rolle spielt bei der Signalisierung von Kalzium, die Neurotransmission und Neurogenese12,13auswirken. Dysfunktion des TRPC3 ist mit Störungen des zentralen Nervensystems, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bestimmten Krebsarten wie z. B. Eierstock Adenokarzinom14,15,16verbunden worden. Deshalb verspricht TRPC3 als pharmazeutische Ziel für die Behandlung dieser Krankheiten. Die Entwicklung gezielt Medikamente, die auf TRPC3 wurde durch einen Mangel an Verständnis für die molekulare Aktivierungsmechanismen, einschließlich Lipid Bindung Seiten17,18beschränkt. Wir haben die erste atomarer Auflösung Struktur des menschlichen TRPC3 Kanals (hTRPC3) und seine zwei Lipid-Bindungsstellen im geschlossenen Zustand berichtet, wichtige Einblicke in diese Mechanismen19.
Der entscheidende Faktor für die Bestimmung der Struktur eines Proteins Membran mit hoher Auflösung ist Protein von hoher Qualität zu erhalten. Die entsprechenden Screening von Ausdruck und Reinigung Bedingungen notwendig, hochwertiges Eiweiß zu erhalten kann ein Zeit- und kostenaufwendig Unterfangen sein. Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt im Detail wie ermitteln wir die optimalen Bedingungen für den Ausdruck und die Reinigung des hTRPC3, die in unseren ersten Screening schlecht benommen. Wir präsentieren einige wichtige Punkte zur Problembehandlung und optimieren die Protein-Verhalten, das eine solide Grundlage für unsere Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Studien geschaffen. Wir verwenden eine modifizierte Baculoviral Vektor (pEG), entwickelt von Gouaux und Kollegen, die optimiert ist für das screening-Assays und effiziente Erzeugung von Baculovirus in Säugerzellen20generieren. Dieser Ausdruck-Methode eignet sich für schnelle und kostengünstige Überexpression von Proteinen in der Säugetier-Zelle Membrane. Wir kombinieren die Verwendung dieses Vektors mit einem Fluoreszenz-Detektion Größe-Ausschluss Chromatographie-basierte (FSEC) prescreening Methode21. Diese Methode verwendet einen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tag verschmolzen, das Konstrukt von Interesse und verbessert die Visualisierung des Zielproteins in kleine, ganze Zelle solubilisiert Proben. Dies ermöglicht für das Screening der Proteinstabilität im Beisein von verschiedenen Wasch- und Zusatzstoffe, mit thermostabilizing Mutationen, und ermöglicht die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen aus kleinen transiente Transfektion. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Bedingungen rasch untersucht werden, bevor er zu einer groß angelegten Proteinreinigung. Nach Ausdruck, Screening und Reinigung präsentieren wir ein Protokoll für die Beschaffung und Verarbeitung von Bildern von Cryo-EM, eine de-Novo -Strukturaufklärung des Proteins zu generieren. Wir glauben, dass die hier beschriebenen Vorgehensweisen als verallgemeinerbare Protokoll für strukturelle Studien der TRP-Kanal-Rezeptoren und andere Membranproteine dienen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturaufklärung von Proteinen durch Cryo-EM revolutioniert den Bereich der Strukturbiologie in den letzten Jahren, dank der Entwicklung von neuen Kameras und Algorithmen, die erheblich beschleunigt die Strukturaufklärung von Proteinen, die nicht kristallisieren Sie leicht, besonders Membranproteine. Trotz aller Fortschritte in der Cryo-EM-Technik bleibt die Vorbereitung der gereinigten Proteine in Qualität und Quantität ausreichend qualitativ hochwertige Bildgebung oft Erleichterung zeitaufwendig, teuer und schwie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G. Zhao und X. Meng danken wir für die Unterstützung bei der Erfassung der Daten auf die David Van Andel Advanced Cryo-Elektron Mikroskopie-Suite. Wir freuen uns über die VARI High-Performance-Computing-Team für computational Unterstützung. Wir geben unseren Dank an N. Clemente, D. Gebühren, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth und Z. Ruan für Kommentare, die diese Handschrift stark verbessert. Wir danken D. Nadziejka für redaktionelle Unterstützung für diese Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch interne VARI Finanzierung.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
