Denne protokol beskriver teknikker, der anvendes til at bestemme ion-kanal strukturer af kryo-elektronmikroskopi, herunder en baculovirus, der anvendes til effektivt express gener i pattedyrceller med minimalt besvær og toksicitet, protein udvinding, rensning, og kvalitet kontrol, gitter forberedelse af prøver og screening, samt indsamling af data og forarbejdning.
Forbigående receptor potentielle kanaler (TRPCs) af de kanoniske TRP underfamilie er nonselective kation kanaler, der spiller en afgørende rolle i calcium homeostase, især butik-drevet calcium indrejse, der er afgørende for at opretholde ordentlig funktion af Synaptic vesikel frigivelse og intracellulær signalering veje. Derfor har TRPC kanaler været impliceret i en bred vifte af menneskelige sygdomme, herunder hjerte-kar-lidelser som Hjertehypertrofi, neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom og neurologiske sygdomme såsom spinocerebellar ataksi. Derfor repræsenterer TRPC kanaler et potentielle farmakologiske mål i menneskelige sygdomme. De molekylære mekanismer af gating i disse kanaler er dog stadig uklart. Er svært at opnå store mængder af stabile, homogene og renset protein har været en begrænsende faktor i struktur bestemmelse undersøgelser, især for pattedyr Membranproteiner såsom TRPC Ionkanaler. Vi præsenterer her, en protokol for den store udtryk for pattedyr ion-kanal Membranproteiner ved hjælp af en modificeret baculovirus gen transfersystemet og rensning af disse proteiner af affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi. Yderligere præsenterer vi en protokol til at indsamle enkelt-partikel cryo-Elektron Mikroskopi billeder fra oprenset protein og bruge disse billeder til at bestemme protein struktur. Struktur bestemmelse er en kraftfuld metode til at forstå mekanismerne af gating og funktion i Ionkanaler.
Calcium er involveret i de fleste cellulære processer herunder signalering cascades, transskription kontrol, neurotransmitter frigivelse og hormon molekyle syntese1,2,3. Det homeostatiske vedligeholdelse af cytosole gratis calcium er afgørende for sundhed og funktion af celler. En af de vigtigste mekanismer af intracellulære calcium homeostase er butik-drevet calcium post (SOCE), en proces, hvori opbevares nedbrydning af calcium i det endoplasmatiske reticulum (ER) udløser åbning af Ionkanaler på plasma membran til at lette de genbestilling af ER calcium, som derefter kan bruges i yderligere signalering4,5,6. Forbigående receptor potentielle kanaler (TRPCs), som er calcium-gennemtrængelige kanaler tilhører TRP superfamilien, er blevet identificeret som en vigtig deltager i SOCE7,8,9 .
Blandt de syv medlemmer i familien TRPC, TRPC3, TRPC6 og TRPC7 udgør en homolog undergruppe, og de er unikke evne til at blive aktiveret af lipid sekundære messenger diacylglycerol (DAG), en nedbrydning produkt af den signaling lipid phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2)10,11. TRPC3 er stærkt udtrykt i glatte muskulatur og i de cerebrale og cerebellare regioner af hjernen, hvor det spiller afgørende roller i calcium signalering, der påvirker neurotransmission og neurogenese12,13. Dysfunktion af TRPC3 har været knyttet til central nervesystemet, hjerte-kar-lidelser og visse kræftformer såsom æggestokkene adenocarcinom14,15,16. Derfor holder TRPC3 løfte som farmaceutiske mål for behandling af disse sygdomme. Udvikling af specielt målrettet narkotika handler på TRPC3 har været begrænset af mangel på forståelse af dens molekylære aktivering mekanismer, herunder lipid bindende websteder17,18. Vi har rapporteret første atomic-opløsning strukturen af den menneskelige TRPC3 kanal (hTRPC3) og dens to lipid bindingssteder i lukket tilstand, give vigtig indsigt i disse mekanismer19.
Den vigtigste faktor til at bestemme strukturen af en membran proteiner med høj opløsning er at få protein af høj kvalitet. Tilsvarende screening af proteinekspression og -oprensning betingelser for at opnå høj kvalitet protein kan være en tidskrævende og dyre bestræbelse. Her præsenterer vi en protokol, der beskriver i detaljer hvordan vi identificere de optimale betingelser for den proteinekspression og -oprensning af hTRPC3, som opførte sig dårligt i vores indledende screening. Vi præsenterer flere vigtige punkter om, hvordan fejlfinding og optimere protein adfærd, som lå et solidt fundament for vores cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM) undersøgelser. Vi bruger en modificeret baculoviral generere vektor (pind), udviklet af Gouaux og kolleger, som er optimeret til screening-assays og effektiv generation af baculovirus i pattedyrceller20. Dette udtryk metode er velegnet til hurtig og omkostningseffektiv overekspression af proteiner i pattedyr cellemembranen. Vi kombinerer brugen af denne vektor med en registrering af fluorescens størrelse-udelukkelse kromatografi-baseret (FSEC) prescreening metode21. Denne metode bruger et grønt fluorescerende proteiner (NGL) tag smeltet til konstruktionen af interesse og forbedrer visualisering af target proteinet i små, hele-celle solubilized prøver. Dette giver mulighed for screening af protein stabilitet i overværelse af forskellige vaskemidler og tilsætningsstoffer, med thermostabilizing mutationer, og tillader brug af et lille antal celler fra små forbigående Transfektion. På denne måde, kan en lang række betingelser screenes hurtigt før du flytter til en storstilet protein oprensning. Efter udtryk, screening og rensning præsenterer vi en protokol for at opnå og behandling af billeder fra cryo-EM til at generere en de novo Strukturbestemmelse af proteiner. Vi mener, at metoderne beskrevet her vil tjene som et generaliserbart protokol for strukturelle undersøgelser af TRP kanal receptorer og andre Membranproteiner.
Strukturbestemmelse af proteiner af cryo-EM har revolutioneret inden for strukturel biologi i de sidste par år, takket være udviklingen af nye kameraer og algoritmer, der markant øger hastigheden struktur bestemmelse af proteiner, der ikke let crystalize, især Membranproteiner. På trods af de seneste fremskridt i cryo-EM teknik forbliver forberedelse af renset proteiner tilstrækkelig kvalitet og mængde til at lette høj kvalitet billeddannelse ofte tidskrævende, dyrt og udfordrende. Evnen til hurtigt express og s…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker G. Zhao og X. Meng for støtte med dataindsamling hos David Van Andel avanceret Cryo-Elektron Mikroskopi Suite. Vi værdsætter VARI High-Performance Computing teamet for computational støtte. Vi giver vores taknemmelighed til N. Clemente, D. afgifter, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth og Z. Ruan for kommentarer, der i høj grad forbedret dette håndskrift. Vi takke D. Nadziejka for redaktionelle støtte til dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet af indre VARI finansiering.
pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
Controller Module | " | CBM20A | |
Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
ethane gas | Airgas | UN1035 | |
Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
Software | |||
Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |