Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro
Summary
Маргинальные зоны B клеток (MZBs) реагировать силы сдвига потока путем переориентации их миграции путь вверх поток. Этот протокол показано, как записывать и анализировать миграции с помощью fluidics блока, насоса, Микроскоп съемочной системы и свободного программного обеспечения.
Abstract
Маргинальные зоны B клетки (MZBs) являются население B-клетки, которые находятся в мыши селезеночной маргинальных зонах, которые окутывают фолликулов. Чтобы достичь фолликулов, MZBs необходимо перенести вверх поперечной силы потока крови. Мы представляем здесь метод для анализа этого потока индуцированной MZB миграции в пробирке. Во-первых MZBs изолированы от Хандра мыши. Во-вторых MZBs поселились на Интегрин лигандов в поток камеры слайды, подвергается сдвига потока и образ под микроскопом во время миграции. В-третьих изображения перенос MZBs обрабатываются с помощью MTrack2 автоматическая ячейки отслеживания плагинов ImageJ, и результирующий треков ячейки являются количественно с помощью инструмента хемотаксис Ibidi. Миграции данных показывают, как быстро переместить ячейки, как часто они изменить направление, ли вектор сдвига потока влияет на их направление миграции и какие Интегрин лигандов участвуют. Хотя мы используем MZBs, метод может быть легко адаптирована для анализа миграции лейкоцитов, который реагирует на силы сдвига потока.
Introduction
Иммунные клетки являются наиболее подвижные клетки в организме человека и часто должны бороться с поперечной силы от крови и лимфы. Однако существует сравнительно мало исследований на сдвиг силы индуцированной миграции лейкоцитов1,2,3,,45. Мы представляем здесь надежный и количественный протокол для анализа реакции иммунной клетки потока в пробирке. Выполнение анализа не требуется изготовление компонентов, и все оборудование и расходные материалы являются коммерчески доступными. В протокол, включая анализ очищения и миграции клеток, может выполняться в один день. Наконец хотя мы описываем миграции маргинальной зоне В-клеток (MZBs), протокол может быть адаптирована для анализа миграции против потока других типов иммунных клеток. Таким образом это возможно использовать этот assay систематически анализировать широкий спектр лейкоциты с панелью всеобъемлющего условий.
MZBs являются население B-клеток, которые, в мыши, находятся только в селезенке и трансфер между интерьер фолликулов и маргинальных зонах6,,78,9. Маргинальные зоны — это слой клеток иммунных клеток примерно 5 – 10 толщиной. Слой клетки окружает фолликулов и состоит главным образом из MZBs и макрофагов, но также инвариантные естественных убийца клеток T (iNKT), дендритных клеток (DCs) и нейтрофилов, среди прочих10. Клетки в маргинальной зоне подвергаются однонаправленный кровотока, возникая от Селезеночной артерии, которые заканчиваются в маргинальных синуса, окружающих фолликула. Кровь течет из отверстия в маргинальных пазухи через краевой зоне и затем собраны в венозные синусы в красной пульпы и восстановлен в циркуляции11. Свободный поток крови моет над MZBs и подвергает их антигенов в крови. MZBs нести антигена в фолликул челночные автоматически между маргинальной зоне и внутри фолликула, который не подвергается крови. Таким образом как MZBs к фолликул, они должны перенести вверх поперечная сила в крови поток12 (Рисунок 1A).
В этом протоколе мы описываем как количественно определить, как иммунной клетки, такие, как MZBs реагировать или нет потока потока в пробирке, для того, чтобы выявить, как они запрограммированы для переноса в естественных условиях. На первом шаге MZBs очищаются от мыши селезенки, используя магнитные бусы, сочетании антитела от коммерчески доступных наборов. Свежевыделенных MZBs представил в колодец слайда потока камеры, разрешено селиться на Интегрин лигандов и воздействию потока миграции буфера с помощью насоса системы (рис. 2A). Клетки отражаются с помощью системы покадровой видео микроскопии. Затем изображения обрабатываются для анализа с бесплатный плагин ImageJ, MTrack213,14, автоматически отслеживать клетки. Треки могут быть количественно затем с бесплатный инструмент Ibidi хемотаксис15 для определения различных параметров, включая скорость прямолинейность и миграции индекс. Эти значения могут использоваться для определения воздействия миграции ингибиторы, стимуляторы клеток, chemokines и других химических веществ, влияющих на миграцию на индуцированного сдвига потока миграции для того чтобы понять силы, контролируя иммунные клетки движение в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод для анализа миграции клеток, которые обнаружить силы сдвига потока и реагировать, не изменяя их миграции. Анализ MZBs показал, что MZBs спонтанно мигрируют на ИКАМ-1 и в присутствии потока, будет мигрировать вверх поток. В нашей предыдущей работы мы показали, что MZBs н?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов от «Deutsche Forschungsgemeinschaft» SFB 854/TP11 K.-д.ф.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
