Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro
Summary
Zona marginale B cellule (MZBs) rispondono alla forza di taglio flusso di ri-orientare il loro percorso di migrazione il flusso. Questo protocollo viene illustrato come registrare e analizzare la migrazione utilizzando un’unità fluidica, pompa, sistema di formazione immagine del microscopio e software libero.
Abstract
Zona marginale B cellule (MZBs) sono una popolazione delle cellule di B che risiedono nelle zone marginali splenici del mouse che avvolgono i follicoli. Per raggiungere i follicoli, MZBs necessario migrare fino la forza di taglio di flusso sanguigno. Presentiamo qui un metodo per analizzare questa migrazione di MZB flusso-indotta in vitro. In primo luogo, MZBs sono isolati dalla milza del mouse. In secondo luogo, MZBs sono sistemati su ligandi delle integrine nelle diapositive di camera di flusso, esposti per inclinare il flusso e imaged sotto un microscopio durante la migrazione. In terzo luogo, immagini di MZBs la migrazione vengono elaborati utilizzando la cella automatica MTrack2 tracking plugin per ImageJ e le tracce di cella risultante vengono quantificate utilizzando lo strumento di chemiotassi Ibidi. I dati di migrazione rivelano quanto velocemente si muovono le cellule, come spesso cambiano direzione, se il vettore di flusso di taglio influisce sulla loro direzione di migrazione e quali ligandi delle integrine sono coinvolti. Anche se usiamo MZBs, il metodo può essere facilmente adattato per l’analisi di migrazione di qualsiasi del leucocita che risponde alla forza del flusso di shear.
Introduction
Cellule del sistema immunitario sono più le cellule nel corpo umano e spesso devono vedersela con forza di taglio dal flusso sanguigno e linfatico. Tuttavia, ci sono relativamente pochi studi sulla migrazione indotta da forza di taglio di leucociti1,2,3,4,5. Presentiamo qui un protocollo affidabile e quantitativo per analizzare la risposta di una cellula immune al flusso in vitro. Esecuzione del saggio non necessita di fabbricazione dei componenti, e tutte le attrezzature e materiali di consumo sono commercialmente disponibili. Il protocollo, tra cui analisi di purificazione e migrazione di cellule, possa essere eseguito in un solo giorno. Infine, anche se Descriviamo la migrazione delle cellule di B di zona marginale (MZBs), il protocollo può essere adattato per analizzare la migrazione contro flusso di altri tipi di cellule del sistema immunitario. Pertanto, è possibile utilizzare questo test per analizzare sistematicamente una vasta gamma dei leucociti con un pannello completo delle condizioni.
MZBs sono una popolazione delle cellule di B che, nel topo, si trovano solo nella milza e navetta tra all’interno dei follicoli e le zone marginali6,7,8,9. La zona marginale è uno strato di cellule immunitarie circa 5 – 10 cellule spesse. Lo strato delle cellule avvolge il follicolo e consiste principalmente di MZBs e macrofagi, ma anche cellule T (iNKT) naturali invarianti dell’uccisore, cellule dendritiche (DCs) e neutrofili, tra gli altri10. Le cellule nella zona marginale sono esposte al flusso di sangue unidirezionale che proviene dalle arterie spleniche che terminano in un seno marginale che circonda il follicolo. Il sangue scorre dai fori nel seno marginale attraverso la zona marginale ed è quindi raccolti nei seni venosi nella polpa rossa e ripristinato la circolazione11. Il libero flusso di sangue lava sopra la MZBs e li espone agli antigeni trasportati nel sangue. Il MZBs portano l’antigene nel follicolo da automaticamente la spola tra la zona marginale ed interno del follicolo, che non è esposto a sangue. Così, come MZBs navetta verso il follicolo, deve migrano fino la forza di taglio del flusso sanguigno12 (Figura 1A).
In questo protocollo, descriviamo come determinare quantitativamente come cellule immuni come MZBs rispondere a nessun flusso o ad alto flusso in vitro, al fine di rivelare come sono programmati per eseguire la migrazione in vivo. Nel primo passaggio, MZBs sono purificati da una milza del mouse usando i branelli magnetici accoppiati agli anticorpi da corredi disponibili nel commercio. Il MZBs appena isolate sono introdotte nel pozzo di una diapositiva di camera di flusso, permesso di insediarsi sul ligandi delle integrine ed esposti al flusso del tampone di migrazione utilizzando un sistema di pompa (Figura 2A). Le cellule sono Imaging utilizzando un sistema di time-lapse video microscopia. Le immagini vengono poi elaborate per l’analisi con un plugin di ImageJ gratuito,13,MTrack214, rintracciare automaticamente le celle. Le tracce possono essere quantificate quindi con il libero Ibidi chemiotassi strumento15 per determinare vari parametri tra cui velocità, rettilineità e indice di migrazione. Questi valori possono essere utilizzati per determinare gli effetti inibitori della migrazione, stimolatori delle cellule, chemochine e altri prodotti chimici che influiscono sulla migrazione della migrazione di shear-flusso indotto al fine di comprendere le forze che controllano il movimento delle cellule immuni in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui un metodo per analizzare la migrazione delle cellule di rilevare la forza del flusso di shear e rispondere, modificando la loro migrazione. Un’analisi di MZBs ha mostrato che MZBs migrare spontaneamente su ICAM-1 e in presenza di flusso, migrerà il flusso. Nel nostro precedente lavoro, abbiamo mostrato che MZBs non migrano il flusso su VCAM-1, ma invece rimangono fissi in luogo. La zona marginale splenica murina contiene principalmente ICAM-1, mentre la polpa rossa contiene sia ICAM-1 e VCAM-1. Da questi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 a K.-D.F.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
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