Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro
Summary
Randzone B Zellen (MZBs) reagieren auf die Kraft des Schubflusses Neuausrichtung ihrer Migrationspfad bis die Strömung. Dieses Protokoll zeigt, wie Sie erfassen und analysieren der Migration mit einem Fluidik-Einheit, Pumpe, Mikroskop-imaging-System und freie Software.
Abstract
Randzone B Zellen (MZBs) sind eine Population von B-Zellen, die in der Maus Milz Randzonen befinden, die Follikel zu umhüllen. Um die Follikel zu erreichen, muss die Schubkraft des Blutflusses MZBs wandern. Wir stellen Ihnen hier eine Methode für die Analyse dieser strömungsinduzierte MZB-Migration in-vitro. Erstens sind MZBs isoliert aus der Maus Milz. Zweitens sind MZBs ließ sich auf Integrin Liganden in Fluss Kammer Folien, Fluss Scherung ausgesetzt und abgebildet unter dem Mikroskop während der Migration. Drittens Bilder von der Migration von MZBs werden mit der MTrack2 automatische Zelle tracking-Plugin für ImageJ verarbeitet, und die daraus resultierenden Zelle Tracks mit dem Ibidi Chemotaxis Werkzeug quantifiziert. Die Migrationsdaten zeigen, wie schnell sich die Zellen bewegen, wie oft sie die Richtung ändern, ob der Scherung Fluss Vektor ihre Migration Richtung auswirkt und welche Integrin-Liganden beteiligt sind. Obwohl wir MZBs verwenden, kann die Methode leicht angepasst werden für die Analyse der Migration Leukozyten, die auf die Kraft des Schubflusses reagiert.
Introduction
Immunzellen sind die meisten bewegliche Zellen im menschlichen Körper und müssen oft mit Querkraft von Blut und Lymphe Strömung kämpfen. Allerdings gibt es vergleichsweise wenige Studien auf Scherung Kraft-induzierte Migration von Leukozyten1,2,3,4,5. Wir stellen Ihnen hier eine zuverlässige und quantitative Protokoll um die Reaktion der einer Immunzelle auf in-vitro-Fluss zu analysieren. Durchführung des Tests erfordert keine Herstellung von Komponenten und alle Geräte und Verbrauchsmaterialien sind im Handel erhältlich. Das Protokoll, einschließlich Reinigung und Migration Zellanalyse, kann an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Schließlich, obwohl wir die Migration der Randzone B-Zellen (MZBs) beschrieben wird, kann das Protokoll angepasst werden um Migration gegen andere Arten von Immunzellen zu analysieren. Daher ist es möglich, dieser Assay verwenden, um eine Vielzahl von Leukozyten mit einer umfangreichen Gruppe von Bedingungen systematisch zu analysieren.
MZBs sind eine Population von B-Zellen, die in der Maus, nur in der Milz und Shuttle gefunden werden, zwischen dem Innenraum der Follikel und die Randzonen6,7,8,9. Die Randzone ist eine Schicht von Immunzellen ca. 5 – 10 Zellen dick. Die Zellschicht die Follikel umhüllt und besteht hauptsächlich aus MZBs und Makrophagen, aber auch invariante natürlichen killer (iNKT) T-Zellen, dendritischen Zellen (DCs) und Neutrophilen, unter anderem10. Die Zellen in der Randzone sind unidirektional Blutfluss aus Milz Arterien, die marginale Sinus rund um die Follikel kündigen ausgesetzt. Das Blut wird fließt aus den Löchern in den marginalen Sinus durch die Randzone und dann in venösen Sinus in dem roten Fruchtfleisch gesammelt und restauriert im Umlauf-11. Der freie Fluss von Blut wäscht über den MZBs und setzt sie auf Antigene im Blut durchgeführt. Die MZBs tragen das Antigen in der Follikel transportiert automatisch zwischen der Randzone und innerhalb der Follikel, die nicht Blut ausgesetzt ist. So müssen sie als MZBs Shuttle in Richtung der Follikel, die Schubkraft der Blut fließen12 (Abbildung 1A) Wandern.
In diesem Protokoll wir beschreiben, wie quantitativ zu bestimmen, wie die Immunzellen wie keine Strömung oder high-Flow-in-vitro-MZBs reagieren, um aufzuzeigen, wie sie sind so programmiert, dass um in Vivozu migrieren. In einem ersten Schritt werden aus einer Maus Milz mit magnetischen Beads gekoppelt an Antikörper aus handelsüblichen Kits MZBs gereinigt. Frisch isolierte MZBs sind in den Brunnen einer Strömung Kammer Folie eingeführt, erlaubt, sich auf Integrin Liganden und den Fluss der Migration Puffer mit einem Pumpensystem (Abbildung 2A) ausgesetzt. Die Zellen werden mit einem Time-Lapse video-Mikroskopie-System abgebildet. Anschließend werden die Bilder zur Analyse mit einem kostenlosen ImageJ-Plugin, MTrack213,14, um die Zellen automatisch zu verfolgen. Spuren können dann mit dem kostenlosen Ibidi Chemotaxis Werkzeug15 verschiedene Parameter wie Geschwindigkeit, Geradheit und Migration Index bestimmen quantifiziert werden. Diese Werte können zu bestimmen, die Auswirkungen der Migration-Inhibitoren, Zelle Stimulatoren, Chemokine und andere Chemikalien Migration beeinflussen auf der Schubfluss induzierte Migration verwendet werden, um die Immunzelle Bewegungskontrolle in-vivo Kräfte zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier eine Methode für die Analyse der Migration von Zellen, die die Kraft des Schubflusses zu erkennen und durch Veränderung ihrer Migration zu reagieren. Eine Analyse der MZBs zeigte, dass MZBs migrieren spontan auf ICAM-1 und im Beisein von fließen, werden migriert, bis die Strömung. In unserer bisherigen Arbeit haben wir gezeigt, dass MZBs nicht den Fluss von VCAM-1 migrieren aber stattdessen fixiert. Der murinen Milz Randzone enthält hauptsächlich ICAM-1, während das rote Fruchtfleisch ICAM-1 u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem “Deutschen Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11, K.-D.F
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
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