Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

Summary

Analisi SEM sono un metodo efficace per aiutare nell’identificazione di specie o discriminazione fenotipica. Questo protocollo descrive i metodi per l’esame di specifici dettagli morfologici dei tre tipi rappresentativi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile ad esaminare le caratteristiche di molti organismi e tipi di tessuto.

Abstract

Microscopia elettronica (SEM) è una tecnica ampiamente disponibile che è stata applicata per lo studio di campioni biologici che vanno da singole proteine, cellule, tessuti, organelli e persino interi organismi. Questo protocollo si concentra su due metodi di essiccazione chimiche, esametildisilazano (HMDS) e alcol t-butilico (TBA) e loro applicazione all’imaging di organismi sia procarioti ed eucarioti utilizzando SEM In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Lo scopo del presente protocollo è di descrivere un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali degli esemplari che possono essere ampiamente applicati a una vasta gamma di organismi per morfologica valutazione. Completamento del presente protocollo permetterà ad altri di utilizzare SEM per visualizzare esempi di applicazione di queste tecniche al loro sistema.

Introduction

Un microscopio elettronico a scansione (SEM) usa un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia per generare un’immagine da elettroni secondari che mostra la morfologia e topografia di un campione¹. SEM può essere utilizzato per determinare direttamente la dimensione fisica di un campione, la struttura della superficie e la forma tridimensionale e offre una risoluzione maggiore e maggiore profondità di campo rispetto alla microscopia. Un’altra forma di microscopia elettronica (EM), microscopia elettronica a trasmissione (TEM) utilizza concentrati gli elettroni che passano attraverso il campione, generando le immagini con dettagli raffinati della struttura interna. Mentre TEM ha risoluzione superiore a quella luce o SEM e può essere utilizzato per risolvere strutture piccole come singoli atomi, ha tre inconvenienti principali: preparazione del campione vasto, un piccola campo di vista e una profondità di campo^2,3. Anche se altri visualizzati protocolli esistano utilizzando SEM per esaminare specifiche cellule, organelli o tessuti^{4,5,6,7,8,9, 10} , questo protocollo è unico in quanto Descriviamo i metodi che possono essere ampiamente applicate a una vasta gamma di organismi per la valutazione morfologica.

SEM ha trovato grandi applicazioni per l’esame di materiali inorganici tra cui nanoparticelle^11,12, polimeri¹³e numerose applicazioni in Scienze geologiche, industriale e materiale^{14, 15,16}. In biologia, SEM è stato utilizzato a lungo come un metodo per l’esame di campioni biologici che vanno da singole proteine a interi organismi^17,18. SEM è di particolare valore perché morfologiche particolari di superficie possono essere utilizzati per informare la scoperta scientifica. Analisi SEM sono un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali di una vasta gamma di campioni biologici.

Perché un SEM opera normalmente sotto alto vuoto (10^-6 Torr minimo) per supportare un fascio coerente di elettroni ad alta velocità, liquidi (acqua, oli, alcoli) non sono consentito nel pozzetto di misurazione, come liquidi che impedire il formarsi di un vuoto. Così, tutti i campioni esaminati usando SEM devono essere disidratati, in genere utilizzando una serie di graduali etanolo seguita da un processo di essiccazione per rimuovere l’etanolo. Ci sono diversi metodi di essiccazione tessuti biologici per l’uso nel SEM, tra cui essiccazione all’aria, liofilizzazione, utilizzo di un dispositivo di punto critico essiccazione (CPD), o essiccazione utilizzando alcol t-butilico (TBA) o esametildisilazano (HMDS)^19, chimica ^{20 , 21 , 22}. più spesso, la selezione di un metodo di essiccazione è empirico poiché ogni campione biologico può reagire diversamente a ogni metodo di essiccazione. Per qualsiasi dato campione, tutti questi metodi può essere appropriati, quindi confrontare i vantaggi e gli svantaggi di ciascuno è utile per selezionare il metodo appropriato.

Mentre aria asciugatura un campione a temperatura ambiente o in un forno di essiccazione (60 ° C) è il metodo più semplice, maggior parte dei campioni biologici mostrano danni indotti da essiccazione come avvizzimento e collasso, con conseguente distorsione del campione. Il processo di liofilizzazione inoltre rimuove l’acqua (o ghiaccio) da un campione, ma richiede campioni per essere congelato flash e messo sottovuoto per rimuovere il ghiaccio tramite il processo di sublimazione, potenzialmente danneggiare il campione. Inoltre, l’utente deve avere accesso a un liofilizzatori. Il metodo più comunemente usato per la disidratazione di campioni per il SEM è punto critico essiccazione (CPD). In CPD, l’etanolo in un campione viene sostituita con liquido anidride carbonica (CO₂) e, sotto specifica condizioni di temperatura e pressione conosciute come il punto critico (31,1 ° C e 1.073 psi), CO₂ vaporizza senza creare tensione superficiale, quindi in modo efficace mantenendo le caratteristiche morfologiche e strutturali del campione. Mentre CPD è generalmente il metodo standard, ha diversi inconvenienti. In primo luogo, il processo richiede l’accesso a un punto critico asciugacapelli, che non è solo costoso, ma richiede anche l’uso di anidride carbonica liquida. In secondo luogo, la dimensione del campione che possa essere essiccato è limitata alla dimensione camera del punto critico asciugacapelli. In terzo luogo, lo scambio di liquidi durante CPD può causare turbolenze che possono danneggiare il campione.

Essiccazione chimica offre molti vantaggi rispetto CPD e serve come un’alternativa appropriata diventando ampiamente utilizzato nella preparazione del campione di SEM. L’uso di dehydrants chimici quali TBA e HMDS offre un’alternativa veloce, poco costoso e semplice ad altri metodi, pur mantenendo l’integrità strutturale del campione. Recentemente abbiamo dimostrato che non c’era nessuna differenza nell’integrità del tessuto o la qualità dell’immagine finale catturato quando si utilizza CPD o TBA come il metodo di essiccazione in adulto Drosophila tessuto retinico²³. A differenza di CPD, TBA e HMDS non necessitano di uno strumento di essiccazione o liquido CO₂ e non c’è nessuna limitazione sulla dimensione del campione per essere asciugato. Oltre a ottenere le sostanze chimiche, solo una cappa chimica standard e appropriati dispositivi di protezione individuale (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) sono necessari per completare il processo di essiccazione. Mentre TBA sia HMDS sono infiammabili, TBA è meno tossico e meno costoso (circa 1/3 del costo di HMDS) di HMDS.

In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Questi organismi rappresentano una vasta gamma di dimensioni (0,5 µm a 4 mm) e la diversità cellulare (unicellulare a pluricellulare), eppure tutte sono facilmente suscettibili di analisi SEM con solo piccole variazioni necessarie per la preparazione dei campioni. Questo protocollo descrive i metodi per l’utilizzo di disidratazione chimica e analisi SEM per esaminare i dettagli morfologici di tre tipi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile all’esame di molti organismi e tipi di tessuto.

Protocol

1. preparazione e la fissazione Preparare i cianobatteri. Coltivare colture unialgali in F/2 media24,25 ad una temperatura di 28 ° C su un 14:10 h ciclo scuro della luce. Trasferire cultura sufficiente in una microcentrifuga da 1,5 mL, in modo che dopo 15 min di stabilirsi, il pellet batterico è circa 0,05 mL di dimensioni. Rimuovere il supporto e sostituire con 1,5 mL di fissativo (1,25% glutaraldeide, 0.1 M tampone fosfato pH 7.0), delicatam…

Representative Results

I cianobatteri sono un procariotico gruppo di organismi che sono fondamentali per il globale del carbonio, ossigeno e azoto cicli28,29. Di circa 6000 specie di cianobatteri30, la maggior parte hanno una guaina mucillaginosa che coprono e collegare insieme le cellule e ad altre strutture31, che, insieme con la forma, può essere risolto microscopicamente32. Dim…

Discussion

Qui abbiamo descritto un protocollo utilizzando SEM per ottenere informazioni dettagliate sulle caratteristiche morfologiche esterne di tre tipi di organismi che gli altri possono applicare per esaminare le caratteristiche di molti tipi di organismi o tessuti. All’interno di ogni passaggio del protocollo, ci sono potenziali punti di errore che possono verificarsi e sono discussi in dettaglio di seguito.

Mentre i volumi per il fissativo e lavaggi dati qui sono specifici, in generale il fissativ…

Materials

gold–palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate	Sigma	WHA110606
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 media	Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	No Catalog number given – see link
AF6 media	Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	No Catalog number given – see link
Soil water medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	No Catalog number given – see link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE	The company doesn't appear to sell this model any longer