Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Summary

Este protocolo está diseñado para evaluar la citotoxicidad de T-cell (T-cell de coche) redireccionada inmunoterapéutico contra células cancerosas estructuradas 3D (esferoides) en tiempo real.

Abstract

La inmunoterapia se ha convertido en un campo de creciente interés en la lucha contra el cáncer de otra manera intratable. Entre todos los métodos de inmunoterapia, receptor del antígeno quimérico (coche) redirigido las células de T obtenidas los resultados más espectaculares, en particular con leucemia linfoblástica aguda-B pediátrica (B-ALL). Métodos de validación clásica de células T auto confían en el uso de especificidad y ensayos de funcionalidad de las células de T automóvil contra las células de la blanco en suspensión y en modelos de xenoinjerto. Por desgracia, observaciones in vitro a menudo se desemparejan de resultados obtenidos en vivo y un montón de esfuerzo y animales podría salvarse mediante la adición de un paso: el uso de la cultura 3D. La producción de esferoides de potenciales células Diana que imitan la estructura 3D de las células tumorales cuando son engrafted en el modelo animal representa una alternativa ideal. Aquí, Divulgamos un método asequible, fiable y fácil de producir esferoides de una línea de células transduced de colon como una herramienta de validación para la terapia celular adoptiva (ejemplificada aquí por las células CD19 coche T). Este método es junto con un avanzado sistema de proyección de imagen vivo que puede seguir el crecimiento del esferoide, efectoras células de citotoxicidad y tumor apoptosis de las células.

Introduction

Transferencia celular adoptiva (ACT) representa el tratamiento de cáncer de próxima generación. Se basa en la inyección de células efectoras (células T o NK) en un paciente. Estas células pueden ser modificadas genéticamente con un receptor que se guía a su destino, el tumor y lo destruyen. Este enfoque fue demostrado recientemente para ser factible cuando un Receptor de antígeno quimérico (coche) dirigido contra el marcador de células B CD19 fue introducido en las células T del paciente para matar su cáncer¹. En el caso del coche, que es un receptor artificial, el diseño consiste de fragmentos de anticuerpos específicos, el antígeno vinculante dominio reducido a un fragmento variable de cadena única designada de entidad (scFv), vinculados a los dominios de señalización del T-cell. Aunque existen varios diseños, las versiones más utilizadas que se refiere como diseños de coches de segunda generación, consisten en CD3z para señalización del TCR y un dominio coestimuladoras (CD28, 4-1BB, OX40, etcetera.) ^{1 , 2}. el campo de la inmunoterapia dirigida la mayor parte de su atención a esta nueva forma de acto cuando las células CD19 coche-T eficazmente trataron numerosos pacientes con neoplasias de células B^3,4. Tras este éxito, los investigadores intentaron explotar los diseños similares apuntando a otros epitopos para tumores sólidos con éxito limitado. Lamentablemente, la escasez de antígenos específicos de tumor y los microambientes de tumor más prestados del coche T células menos eficaces hacia tumores sólidos⁵.

En la actualidad, las estrategias de validación más comúnmente utilizado en vitro dependen de sistemas bidimensionales (2D) que sólo se refieren a un fragmento de los desafíos ya mencionados tumor sólido. Clásico, 2D en vitro sistemas implican una mezcla de células T auto y líneas celulares de cáncer destino como monocapas para evaluar la funcionalidad y la especificidad de estas células efectoras. Aunque estas estrategias son parte importante y vital de los estudios, no toman en consideración la compleja morfología y estructura tridimensional (3D) de las células de cáncer⁶. Las células cancerosas cultivadas en sistemas 3D, denominados esferoides, adquieren nuevos rasgos fenotípicos a través de cambios en el gene expresión perfil⁷, que puedan influir en el reconocimiento por células efectoras redirigida. Birgersdotter y colegas demostraron que una línea de células de linfoma (HL) de Hodgkin cuando se cultiva solamente en un modelo 3D de la cultura adquiere un perfil de expresión génica que es similar al de las muestras del tumor primario⁸. Por lo tanto, esferoides o similar 3D cultura oferta de metodologías más relevantes modelos in vitro frente a los sistemas 2D estándar. Estos sistemas también son similares a estudios in vivo que se ven como el último paso en el proceso de validación de un determinado coche. Teniendo en cuenta que los sistemas 2D no imitan la morfología de racimos de cáncer, esferoides ofrecen formaciones similares para evaluar la funcionalidad de las células de T automóvil antes modelos en vivo. En un estudio, Pickl et al identificaron que un modelo esferoide del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) overexpressing células cancerosas demostraron perfiles de señalización similares a modelos en vivo⁹. Esto apoya aún más que los esferoides ofrecen más relevantes y cerrar-a-en vivo la evaluación de las células de T del coche. Además, validación de coche T-cell contra esferoides podría ayudar a evaluar más críticamente su eficacia y evitar algunos de los diseños que se mueva para estudios in vivo prematuramente¹⁰; contribuyendo a la investigación ética preocupada por sacrificar menos animales. Además, protocolos con esferoides no son más caros que los sistemas 2D clásicos y mucho más rápido en comparación con los estudios clásicos en vivo . Tomados en conjunto, se puede predecir que la inclusión de estudios esferoide se convertirá pronto en práctica estándar para vincular los estudios in vitro e in vivo.

Presentamos la preparación de esferoides de la línea de células de cáncer de colon HCT 116. Esta línea celular fue modificada para expresar la molécula CD19 humana para hacerla sensible a las células CD19 coche T y para proporcionar una evaluación clara de la matanza con una construcción de coche clínicamente validada.

Protocol

1. generación de esferoides de línea celular de cáncer colorrectal Monocapas de células de lavado HCT 116 (transduced estable para expresar del racimo de la diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con el fosfato tampón salino (PBS, 5 mL de 25 cm2 o 10 mL para un frasco de 75 cm2 ). Añadir tripsina (0,5 mL de 25 cm2 o 1 mL para un frasco de 75 cm2 ) e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos. Compruebe separación d…

Representative Results

Como puede verse en la figura 1, es crucial para controlar mediante citometría de flujo, el nivel de expresión de CD19 en células T (figura 1A) y el nivel de CD19 en líneas celulares de tumor HCT116 (figura 1B). Figura 2 ejemplifica el resultado de un experimento típico del esferoide. El aparato de proyección de imagen automatizado toma fotografías en cuatro canal…

Discussion

El uso de esferoides como una innovadora herramienta para validar el tratamiento futuro contra el cáncer se ha convertido en un campo de creciente interés en los últimos años. Esferoides representan un paso intermedio entre el clásico 2D análisis in vitro y en vivo. El método más sostiene una gran promesa en cuanto a su potencia en términos de tumor micro-ambiente imitando así como gene perfiles⁷. El protocolo presentado en esta publicación es una adaptación del Saheen et al<s…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience