Diagnostisering av Hirschsprung ' s Disease av Immunostaining rektal sug biopsier for Calretinin, S100 protein og protein Gene produkt 9,5
Summary
Denne protokollen beskriver prosessen med immunostaining rektal sug biopsier for calretinin, S100 protein, og protein gen produkt 9,5. Denne romanen adjuvant diagnostisk metode for Hirschsprung ‘ s sykdom har å foretrekke følsomhet og spesifisitet priser.
Abstract
Hirschsprung ‘ s sykdom (HD) er en medfødt intestinal sykdom som er klinisk manifestert som en manglende evne til å passere mekonium hos spedbarn eller som langsiktig forstoppelse hos barn. Rektal sug biopsi (RSB) for å fastslå fraværet av Ganglion celler og neural hypertrofi er den mest nøyaktige testen for diagnostisering av HS i dag. Tradisjonelle hematoksylin-eosin farging mangler følsomhet og spesifisitet. Acetylkolinesterase farging kan ikke brukes mye på grunn av den kompliserte prosessen. Vår roman protokoll av immunostaining for calretinin, S100 protein, og protein genet produkt 9,5 (PGP 9.5), som vi gjennomførte på RSBs, utstillinger høy følsomhet og spesifisitet priser på 96,49% (95% tillit intervall, 0.88-0.99) og 100% (95% tillit intervall, 0.97-1.00), henholdsvis. De HD-berørte segmentene ofte til stede som fravær av uttrykk for calretinin, S100 protein, og PGP 9.5, som er markører for neural hypertrofi i submucosal vev. Denne protokollen beskriver den detaljerte operasjons prosessen for denne nye diagnostiske metoden.
Introduction
Hirschsprung ‘ s sykdom (HD) er en felles medfødt tarm uorden preget av mangel på Ganglion celler i ulike segmenter av den, den er i den forskjellige tarmkanalen1. Den menneskelige enteric nervesystemet dannes når invasjonen av embryonale nevrale celler er fullført. Hvis det er en forstyrrelse av prosessen og invasjonen ikke klarer å fullføre, blir den som går i tarmen til den nyfødte aganglioniske2. Denne potensielt fatale tilstanden kalles Hirschsprung ‘ s sykdom. Spredning, motilitet, og gut vekst er de tre viktigste komponentene i vellykket kolonisering.
Tradisjonelle hematoksylin og eosin (H & E) farging av en begrenset submucosal biopsi kan ikke oppnå så tilfredsstillende resultat som H & E farging av en full-tykkelse vev innhentet fra kirurgi. I tillegg acetylkolinesterase (smerte) farging av rektal suge vev er teoretisk utfordrende på grunn av sin utilstrekkelig følsomhet, som er 91%, og kompleks behandling av frosne seksjoner3,4. Flere andre immunhistokjemiske markører av Ganglion celler og nervefibre som kan beiset i formalin-fast og parafin-embedded eksemplarer er gradvis blitt mainstream HD-diagnostikk. Calretinin er et vitamin D-avhengig kalsium-bindende protein som ikke er uttrykt i myenteric og submucosal plexus av HD-berørte segmenter5. S100 protein uttrykkes i celler avledet fra neural Crest, som nervefibre og gliacellene celler, som ofte presenterer neural hypertrofi i submucosal vev av HD-berørte segmenter6. Protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5) pålitelig flekker nervefibre og Ganglion celler; PGP 9.5 farging fungerer som et supplement til calretinin farging, spesielt i tilfeller av isolerte hypoganglionosis. Dobbel farging med S100 og PGP 9.5 kan redusere falske negative rate og øke følsomheten. Som en forutsetning, den nåværende studien tar sikte på å sikre tilstrekkelig spesifisitet og høy følsomhet for denne romanen diagnostisk metode. Vår roman protokollen brukte alle tre markører for diskriminering av aganglioniske tarmen og hypertrofisk nervefibre. En fremtidig studie av 318 barn ble utført av vår Lab og tidligere publisert uten en detaljert protokoll7. Den detaljerte protokollen og forholdsregler er diskutert i denne artikkelen. Eventuelle nyfødte som led av en alvorlig avføring problem siden fødselen eller barn med kronisk forstoppelse unntatt andre vanlige sykdommer er potensielle kandidater for rektal sug biopsi (RSB). Vår romanen protokollen er egnet for farging ikke bare RSBs men også full-tykkelse biopsier eller kirurgiske prøver å lage en endelig diagnose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet en prosedyre som bruker tre forskjellige immunhistokjemiske antistoffer for å flekk RBS seksjoner for diagnostisering av HS. Følsomheten til vår diagnostiske protokoll var 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), og spesifisitet var 100% (95% CI, 0.97-1.00).
De mest kritiske trinnene i protokollen er RSB og antigen-antistoff reaksjon. Størrelsen på biopsi bestemmer nøyaktigheten av farging. En liten biopsi vil ikke gi nok vev til å gjøre en presis diagnose, mens en stor biopsi …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Weibing tang for sin store hjelp i å gi filming Lab. Denne artikkelen er støttet av offentlig velferd Research, og spesielle midler ble mottatt fra den nasjonale helse og familieplanlegging av Kina (Grant no. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
