密度勾配遠心法を用いた差動品質の精液採取
Summary
本稿では、密度勾配遠心法と精子の生理学的研究への応用のパフォーマンスについて説明を目指します。
Abstract
有性生殖、雄性配偶子または精子細胞は、受精させる雌性配偶子の融合します。ただし、受精を保障する雌性配偶子と対話する能力を肥やすことで精子の数が多いが必要。など、個々 の精子の受精能力は、正常な再生のため重要です。密度勾配遠心法は、生殖補助医療に使用される質の高い精子だけを収集する再現性の高い、高速、効率的、効果的な非常に適応可能である方法として数十年間利用されています。我々 はここに記載されているプロトコルはその品質によってオンドリの精子の 3 つの異なる集団を隔離する不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) 技術の活用に焦点を当てます。低、中、高品質の精子を収集することができました。生存率、モビリティ、および透過性を評価することにより精子の決定の不妊の可能性を伴う再現性のあるプロトコルについて述べる。PDGC 技術を使用してその品質によって精子のコレクションは正確に有用であるし、徹底的に差分不妊治療の可能性と精子を特徴付けます。
Introduction
脊椎動物、雄性配偶子を受ける強烈な選択圧;したがって男性の生殖のフィットネス、成功受精を達成するために極めて重要です。すべての脊椎動物種の男性は、受精のニーズを満たすために十分な品質と大量に精子細胞を生成できる必要があります。精子細胞、精子頭部と、鞭毛を持つは、体内で最も偏光セルです。また、精子の質の非常に異質です (ライブと死んで、形態学的正常と異常、および不動、低モバイル、高モバイル)、男性の生殖効率の変動幅を明らかには。なるほどの正常に卵子を受精に必要な交配の数は減りますが、質の高い精子の割合。しかし、不妊治療を達成するために形態学的に正常精子細胞はオスミウム酸1を浸透するも受精のサイトに到達する彼らの鞭毛によって生成された推進力に頼る (ZP 哺乳類の場合) または内部囲レイヤー2 (IPVL の鳥類と爬虫類の場合) 次の自然交配または人工授精 (AI) 卵子の。精子を決定する品質は生殖補助医療技術3 (アート) で使用するために必要な AI で使用される繁殖の男性の選択プログラム4。その一方で、アートの成功はもっぱら精子の質の正確な評価に依存します。多くの検査は精子の機能の特性を決定する開発されています。最も重要なパラメーターは、精子形態、生存率、モビリティ、精子 (鳥精子受精5は必要ありません)、精子、精子先体反応 (AR; エキソサイトーシスと精子頭部の先体からの蛋白分解酵素の放出)ZP や IPVL、受精6,7,8,9,10,11の浸透。不妊治療だけでの対策では、精子人口11の受精能力の正確な評価は提供しません。受精卵が受精に至るまでいくつかのイベントの対策個別精母細胞7のパフォーマンスの適切な表現を可能にします。
精子機能を測定するために開発された方法論は、主に種特異的です。たとえば、鳥の精子の生存率、移動性および IPVL の浸透、精子品質8,11,12を評価するために使用される最も一般的なパラメーター。射精のライブ精子の数は、死者の精子精液中の多数の存在が精子の質に影響するので精子の生存のための重要な役割を果たしています。これは、精液における活性酸素種の生産を高め、ライブ精子13に酸化的損傷を引き起こします。精子移動、体の温度、抵抗に対して鳥精子の鞭毛運動のための能力は、受精8について持って来ることで直接的な役割を再生する知られています。モビリティが不妊とは正の相関し、は、したがって、不妊治療8の主要な決定要因は、定着します。ただし、モバイルの精子には AR を受けると IPVL11を貫通する能力も必要です。IPVL 浸透アッセイ受精11の過程で関与するすべての精子を考慮に入れます。
アートのアプリケーションで射精は通常質の高い精子の濃度を最大化し、低品質の精子の濃度を最小限にするために処理されます。精液の採取後、業界と研究実践でよく使用される精子分離手順高品質精子の割合を濃縮することができます。これらの手順の多くが開発されているすべてをそれぞれの利点と制限事項が、すべては異種精子受精能力の高い精子だけを収集する性質を利用します。精子の移行方法、遵守列ろ過密度勾配遠心法 (DGC)14,15,16,17,18,19などの手順,20します利用可能な技術の中で DGC 非常にシンプルでコスト効果の高い、反復可能で受精14のチャンスを最大化することを目標にアート用高品質精子の最大の量を分離することで効率的に発見されました。,15します。 さらに、DGC は精子細胞膜に有害ではないです。対照的に、精子の移行方法収集だけ徐々 にモバイル精子18,19, が収集した精子の量が非常に低く、大量の精子18,の収集に非効率的なこと20. 付着列ろ過は精液17から機動性の高い精子をフィルタ リングで非常に効率的ただし、精子膜20,21に害がある傾向にあります。
密度勾配を生成するための最も一般的に使用される基板は、DGC 技術 Percoll polyvinylpryrolidone でコーティングしたコロイド状シリカ粒子から成っています。連続または不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) を指定できますが、不連続勾配は機動性の高い精子13,16,20の高収率分離でよく使用されます。不連続勾配の低い密度メディアに浮かんで高密度メディア、円錐管の底に上から密度が増加するグラデーションを作成します。これは異なる密度の 2 つのメディア間のインターフェイスに境界を作成します。PDGC の効率は 2 つの要因から派生した: 1) 個々 の精子細胞と 2) 密度が増加する構造的整合性が高い精子細胞の傾向の推進能力。高いモビリティと精子、低密度メディアからクロスし、高密度メディアに浸透することができます。低い機動性精子は異なる密度の媒体間のインターフェイスによって作成された境界に閉じ込めになるより可能性があります。高い構造健全性とモビリティの精子細胞は死んで、異常または低のモバイル精子細胞より高い密度を持っている傾向があります。PDGC で遠心力を適用すると、グラデーションの各場所に密度の異なる精子の動きこれ容易になります。
一般的な実習で PDGC を実行すると後は、円錐管の下部に潜在的な高い出生に精子の柔らかいペレットを収集すると、し、残りの部分は破棄されます。しかし、この手法の活用の利点は品質の違いに基づいていくつかのグループに精子細胞を分けるその機能です。研究用 PDGC 技術を活用した品質の程度によって精子の分離それは生理学的、メタボローム、プロテオームの違いに関係、精子の質の研究できます。モビリティ、および精子 IPVL 以前に確立されたエオシン nigrosin 生存率、生体染色、Accudenz の試金を使用して品質のこれらの違いを示すと同様、別の精子の品質によって、この手法を使用する方法の詳細をここでは、目指す透過性の相互作用アッセイ。
Protocol
Representative Results
Discussion
不妊治療は、動物生産の収益性を決定するだけでなく、存在のための種の自然淘汰の手段としても機能します。精子細胞の究極の機能は、卵子を受精することです。女性の卵管は卵子23,24の受精を保障するためにそれらの適者生存精子のみを選択します。生体外研究も質的な精子と受精成功4,11,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
なし。
Materials
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
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