JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Neurosciences

Lipid tolagede eksperimenter med kontakt boble dobbeltlag for Patch-Clampers

Published: January 16, 2019
doi:
10.3791/58840
,
1Department of Molecular Physiology and Biophysics,University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for dannelsen af lipid dobbeltlag ved hjælp af en kontakt boble tolagede metode. En vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel, hvorved en éncellelag dannes på grænsefladen vand-olie. To pipetter er manipuleret til at forankre boblerne til at danne en tolagede.

Abstract

Lipid dobbeltlag giver en unik eksperimentelle platform for funktionelle studier af Ionkanaler, giver undersøgelsen af kanal-membran interaktioner under forskellige membran lipid kompositioner. Blandt dem, har droplet interface tolagede vundet popularitet; dog hindrer den store membran størrelse optagelsen af lav elektriske baggrundsstøj. Vi har etableret en kontakt boble tolagede (CBB) metode, der kombinerer fordelene ved planar lipid tolagede og patch-clamp metoder, såsom evnen til at variere lipid sammensætning og manipulere tolagede mekanik, henholdsvis. Ved hjælp af setup for konventionelle patch-clamp eksperimenter, kan CBB-baserede eksperimenter let udføres. Kort sagt, en elektrolyt opløsning i et glas pipette er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opretholdes til at opnå en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med et lipid éncellelag (ren lipider eller blandet lipider), som er leveret fra Liposomer i boblerne. Næste, de to éncellelag-foret bobler (~ 50 µm i diameter) på spidsen af glas pipetter er forankret til tolagede dannelse. Indførelsen af kanal-rekonstitueres Liposomer i boblen fører til inddragelsen af kanaler i tolagede, giver mulighed for single-channel nuværende optagelse med et signal / støj-forhold sammenlignes med patch-clamp optagelser. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensætning der let dannes. CBB er fornyet gentagne gange af blæser ud de foregående bobler og danner nye. Forskellige kemiske og fysiske forstyrrelser (fx, membran perfusion og tolagede spænding) kan pålægges CBBs. Herein, præsenterer vi den grundlæggende procedure for CBB dannelse.

Introduction

For Ionkanaler er cellemembranen ikke blot en understøttende materiale, men en partner til at generere ion flux. Funktionelt, membranen er en elektrisk isolator som ion kanaler er integreret, og alle cellemembraner er formidles med en hvilende membran potentiale. Konventionelt, blev en vilkårlig membran potentiale indført fra et eksternt kredsløb som elektrisk strøm gennem kanalerne blev målt. Denne kvantitative evaluering af ion flux på forskellige membran potentialer afslørede de molekylære egenskaber af disse kanaler, såsom deres ion-selektiv gennemtrængning og gating funktioner1,2. Membran-platform for funktionelle studier af Ionkanaler er enten cellemembranen eller lipid tolagede membran. Historisk, enkanalet elektriske aktuelle optagelser blev uropført i lipid dobbeltlag3,4, og de relevante teknikker blev udviklet for cellemembraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da har disse to teknikker har udviklet sig separat til forskellige formål (figur 1)7,8.

Membran lipider og tolagede membraner er i øjeblikket genstand for forskning for deres roller i støtte struktur og funktion af proteiner, kanal. Derfor er klar tilgængeligheden af metoder til at variere lipid sammensætning i dobbeltlag i høj efterspørgsel. Lipid tolagede dannelse metoder såsom planar lipid tolagede (PLB)8,9,10,11, vand-i-olie droplet tolagede12og slipværktøj interface tolagede (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er fælles valg, give mulighed for at undersøge funktionen kanal under varierende lipid kompositioner20. Selv om DIB er teknisk meget lettere at producere end de konventionelle PLB, den store størrelse af DIB’EN har skabt en hæmsko for patch-clampers til at anvende det til at studere enkanalet aktuelle optagelser med sædvanlige mellemstore ledningsevne (< 100 pS).

For at omgå baggrundsstøjen, skal området tolagede minimeres. Denne sag minder om gentagelser af historie i udvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid dobbeltlag (figur 1). I de tidlige dage, blev en små tolagede (1-30 µm i diameter) dannet på spidsen af en pipette (tip-dip metode; Figur 1 C) 21 , 22 , 23, fremfor at bruge et fritstående tolagede (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tip-dip metode tilladt for elektriske målinger med meget lavere baggrund støj24. Vores erfaringer med PLB-25,26, tip-dip22,23,27og patch-clamp28,29,30, 31 metoder førte os til en roman idé med at danne lipid dobbeltlag ved hjælp af principperne om vand i olie tolagede. Vi har nævnt dette som kontakt boble tolagede (CBB) metode20,32. I denne metode, i stedet for at hænge vanddråber i en olie fase (fig. 1D), en vand boble er sprunget fra et glas pipette (med tip diameter af ca. 30 µm) ind i olie fase (figur 1E og 2), hvor den boble bevares ved at anvende en konstant pres. En éncellelag former spontant på grænsefladen vand-olie på overfladen af boble. Derefter to bobler er forankret gennem manipulation af to glas pipetter, og tolagede er dannet da de to encellelag nærmer sig hinanden, giver en ligevægt tolagede område. Størrelsen af boblen er kontrolleret af de intra-boble pres (holding pres), og ligeledes tolagede størrelse. En gennemsnitlig diameter på 50 µm bruges ofte. Selv om mængden af boblen er lille (< 100 pL), den er forbundet til den større mængde af den pipette løsning, der er i området microliter, der udgør hovedparten elektrolyt fase.

Der er mange fordele ved at bruge metoden CBB (tabel 1). Som en lipid tolagede dannelse teknik, membraner i forskellige lipid kompositioner kan produceres og asymmetriske membraner er mere let dannede32 end er dem af de konventionelle folde metode33. Tolagede kan manipuleres mekanisk, i modsætning til de konventionelle PLB, der kun kan være bøjet med en hydrostatisk tryk forskel34,35. Ved at ændre bedrift pres, boblerne enten udvide eller formindske, fører til øget eller nedsat membran spænding32. Tolagede er mekanisk aftagelig i encellelag, svarende til fryse-fraktur teknik36,37 af membraner i morfologiske undersøgelser, men med CBB, en manøvre giver mulighed for gentagne løsrive og vedhæfte cyklusser32 . Den lille mængde af elektrolytten løsning inden boblen giver mulighed for effektiv fusion af kanal-rekonstitueres Liposomer til tolagede, og sandsynligheden for at få kanal optagelser er meget højere end med de konventionelle PLB teknik. Lille boble volumen tillader også hurtig perfusion (inden for ~ 20 ms) en gang en anden injektion pipette er indsat i enten af boblerne. I modsætning til metoden patch-klemme når brudt, en CBB membran er re-formes straks og gentagne gange og pipetter kan bruges flere gange om dagen. Ved at integrere fordelene patch-clamp og PLB metoder, giver CBB en alsidig platform for at variere de fysisk-kemiske betingelser af membran, giver mulighed for hidtil uset undersøgelser af kanal-membran interaktioner.

Forelægge en detaljeret protokol af CBB dannelsen processen, er fysisk-kemiske baggrunden af tolagede dannelsen præsenteret første, som vil være nyttige for patch-clampers at løse eksperimentelle problemer vedrørende membran dannelse der er stødt på.

CBB eksperimenter give lektioner af overfladekemi videnskab38. CBB ligner en sæbeboble, blæst fra en halm i luften, hvor ligeledes en vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel. Man vil bemærke, at en vand boble næppe er oppustet når membran lipider ikke er inkluderet i vand boblen eller den organisk opløsningsmiddel. I mangel af amphipathic lipider, overfladespænding på en vand-olie interface er høj, og intra-boble presset til at blæse en boble vil være høj. Dette er en erkendelse af Laplace ligning (Δp = 2 γ/R, hvor Δp er intra-boble pres, γ er overfladespænding, og R er boble radius). Når koncentrationen af lipider i enten den organiske fase eller elektrolyt opløsning er høj, tætheden af lipider i éncellelag stiger, da dikteres af Gibbs adsorption isoterm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γ,jeg er den overflade overskydende af sammensatte jeg, og µ,jeg er den kemiske potentiale af komponent jeg)39, fører til en lavere overfladespænding og lethed af boble dannelse. I CBB, tolagede kan ses fra en tangential vinkel (figur 2), og kontakt vinklen mellem éncellelag og tolagede er målelige. Denne vinkel repræsenterer en ligevægt mellem surface tensions af éncellelag og tolagede (unge ligning: γbi = γmo cos(θ), hvor γbi er tolagede spændinger, γmo er éncellelag spænding og θ er den kontakte vinkel). Ændringer i den kontaktperson vinkel angiver ændringer i tolagede spænding, da der éncellelag spændinger er vurderes ud fra ændringer i den kontaktperson vinkel som en funktion af membran potentiale (Young-Lippmann ligning: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) – cos (θv)), hvor Cm er membran kapacitans, V er membran potentiale, og θ0 og θv er de kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er tæt nok, nærmer de hinanden spontant. Dette er på grund af van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske proces i CBB dannelse.

Et CBB system består af særskilte faser: nemlig en bulk olie fase, vand bobler belagt med en éncellelag og en kontakte tolagede (figur 3). Disse er minder om flere faser observeret i en PLB, såsom en opløsningsmiddel-holdige torus omkring den tolagede og en tynd organiske fase klemt af to encellelag43,44. I CBB, éncellelag fasen er løbende med tolagede folder og lipid molekyler diffuse let mellem éncellelag og indlægssedlen. Éncellelag fasen dækker det meste af den boble overflade, der udgør den store fase, der fungerer som et lipid reservoir. Fordi den hydrofobe hale af lipider i éncellelag udvider udad til bulk olie fase, åbner kraterets tolagede eller den hydrofobe core til bulk olie fase. En hydrofobe stof sprøjtes ind i olie fase tæt på tolagede er således let adgang kraterets tolagede. Dette er den membran perfusion teknik vi havde udviklet for nylig45, hvorved lipid sammensætning i tolagede ændres hurtigt (inden for et sekund) under single-channel nuværende optagelser. Vi fandt, at kolesterol indhold i tolagede reversibelt kunne kontrolleres ved at skifte kolesterol perfusion og slukker45. I tilfælde af, at koncentrationen af det pågældende stof i éncellelag og tolagede adskiller sig, opløses koncentration graduering af det relevante stof straks gennem diffusion, der er kendt som Marangoni effekt46, 47. på den anden side flip-flops på tværs af encellelag er langsom48,49,50.

Ved hjælp af metoden CBB, tolagede dannes under alsidig fysisk-kemiske forhold, såsom en elektrolyt pH så lavt som 1 51, salt (K+, Na+, osv.) koncentration op til 3 M, en membran potentiale så højt som ±400 mV og et system temperatur på op til 60 ° C.

Der er flere muligheder for dannelsen af CBB og indarbejdelse af kanal molekyler deri. For dannelsen af éncellelag på grænsefladen vand-olie, er lipider tilføjet enten i et organisk opløsningsmiddel (lipid-out metode; Figur 4 A, 4 C) eller i en boble som Liposomer (lipid-i metode; Figur 4 B, 4 D). Navnlig, lipid-i metode giver mulighed for dannelse af asymmetriske membraner15,32. Kanal molekyler opløseligt i vandig opløsning (fx, kanal-dannende peptider) tilføjes direkte ind i den boble (figur 4A, B)52,53, hvorimod kanal proteiner er fremstillet i Liposomer, der tilføjes derefter ind i boblen (figur 4C, D). Heri, dannelsen af CBBs af lipid-i-metoden til enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, figur 4C) er vist.

Protocol

1. Forbered Liposomer Sprede fosfolipider (f.eks, 10 mg pulveriserede) i kloroform ved en ønskede koncentration (f.eks, 10 mg/mL). Fordampe chloroform. Sted phospholipid løsning i en runde-bunden kolbe og sæt den på en roterende fordamper (Se Tabel af materialer) tilsluttet en N2 gas cylinder. Rotere kolben under N2 flow ved stuetemperatur, indtil en tynd phospholipid film vises (efter ~ 30 min). Åben kolben i en ekssikka…

Representative Results

En typisk CBB havde en diameter på 50 µm (figur 56) og den specifikke membran kapacitans i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Boble størrelsen var vilkårligt kontrolleret af intra-boble pres. Når små bobler er nødvendige for støjsvage optagelser, skal tip diameter være tilsvarende mindre. For eksempel, for en boble størrelsen af 50 µm i diameter, skal tip diameter være 30 µm. <p class="jove_content" fo:keep-together.with…

Discussion

Metoden CBB af lipid tolagede dannelse er baseret på princippet om en vand-i-olie droplet foret af en éncellelag20. Teknisk, procedurer for at danne CBBs er let, især for patch-clamp forskere, der er dygtige i manipulere glas Mikropipetter. Den elektrofysiologiske setup nemlig den lappe klemme bruges let i CBB, når to pipette manipulatorer med microinjectors er tilgængelige. På den anden side fordi CBB er en efterfølger til den konventionelle PLB, for hvilke en stor mængde af fysisk-kemisk…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet i en del af KAKENHI grant numre 16H 00759 og 17 H 04017 (så).

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (2009).
  8. Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S., Okada, Y. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. , 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a., Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -. G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. . Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , (2003).
  39. Butt, H. -. J., Kappl, M. . Surface and Interfacial Forces. , (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H., Miller, C. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. , 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. . Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochimie. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochimie. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochimie. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it’s a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Keywords: Lipid BilayerContact Bubble BilayerPatch-clampingPlanar Lipid BilayerMembrane VibrationSingle Channel CurrentPhospholipid SuspensionProteoliposomesIon Channel ProteinsGlass PipettesMicro ForgeSiliconizing ReagentInverted Microscope
check_url/fr/58840?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image