Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.

Abstract

Lipide-bilayers bieden een unieke experimenteel platform voor functionele studies van ionenkanalen, waardoor het onderzoek van kanaal-membraan interacties onder verschillende membraan lipide composities. Onder hen, steeds de druppel interface dubbelgelaagde populairder; echter belemmert de grootte groot membraan de opname van lage elektrische achtergrondgeluiden. Wij hebben vastgesteld dat een contact zeepbel dubbelgelaagde (CBB) methode die de voordelen van de vlakke lipide dubbelgelaagde combineert en patch-clamp methoden, zoals de mogelijkheid om te variëren van de samenstelling van lipide en te manipuleren de dubbelgelaagde mechanica, respectievelijk. Het gebruik van de instelling voor conventionele patch-clamp experimenten, kunnen CBB gebaseerde experimenten gemakkelijk uitgevoerd worden. In het kort, een elektrolyt oplossing in een glazen pipet is geblazen in een organische oplosmiddelen fase (hexadecaan), en de druk van de pipet wordt gehandhaafd om het verkrijgen van een stabiele belgrootte. De zeepbel is spontaan bekleed met een enkelgelaagde voor lipide (lipiden zuivere of gemengde lipiden), die wordt geleverd door liposomen in de bubbels. Vervolgens zijn de twee enkelgelaagde omzoomde bubbels (~ 50 µm in diameter) op het puntje van het glas pipetten gedokt voor dubbelgelaagde vorming. Binnenbrengen van de zeepbel van kanaal-gereconstitueerd liposomen leidt tot de integratie van kanalen in de dubbelgelaagde, waardoor de huidige opname eenkanalig met een signaal-ruisverhouding vergelijkbaar met die van de patch-clamp opnames. CBBs met de samenstelling van een asymmetrische lipide worden gemakkelijk gevormd. Het CBB is herhaaldelijk vernieuwd door het uitblazen van de eerdere belletjes en de vorming van nieuwe. Verschillende chemische en fysische verstoringen (b.v., membraan perfusie en dubbelgelaagde spanning) kunnen worden opgelegd aan de Herein CBBs., presenteren we de basisprocedure voor het CBB vorming.

Introduction

Ionenkanalen is het celmembraan niet gewoon een ondersteunende materiaal maar een partner voor het genereren van de ion-flux. Functioneel, het membraan is een elektrische isolator welke ion kanalen zijn ingesloten, en alle celmembranen zijn bijgebracht met een rust membraanpotentiaal. Conventioneel, was een willekeurige membraanpotentiaal van een externe schakeling waarop elektrische stroom via de kanalen werd gemeten opgelegd. Deze kwantitatieve evaluatie van de ion-flux op verschillende membraan potentieel bleek de moleculaire eigenschappen van deze kanalen, zoals hun ion-selectieve permeatie en gating functies^1,2. Het membraan platform voor functionele studies van ionenkanalen is de celmembraan of het membraan van de dubbelgelaagde lipide. Historisch, eenkanalig elektrische huidige opnames in première gingen lipide bilayers^3,4, en de relevante technieken werden ontwikkeld voor celmembranen, zoals de methode van de patch-clamp (Figuur 1A )^5,6. Sindsdien hebben deze twee technieken afzonderlijk ontwikkeld voor verschillende doeleinden (Figuur 1)^7,8.

Membraan lipiden en dubbelgelaagde membranen zijn momenteel de focus van het onderzoek voor hun rol bij de ondersteuning van de structuur en functie van eiwitten van het kanaal. Daarom is de beschikbaarheid van methoden om te variëren van de samenstelling van lipide in bilayers in hoge vraag. Lipide dubbelgelaagde vorming methoden zoals de vlakke lipide dubbelgelaagde (PLB)^8,9,10,11, water-in-olie druppel dubbelgelaagde¹²en druppel interface dubbelgelaagde (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} technieken (Figuur 1) zijn gemeenschappelijke keuzen, bieden een gelegenheid voor de behandeling van de functie van de kanaal onder variërende lipide composities²⁰. Hoewel de DIB technisch veel gemakkelijker is te produceren dan de conventionele PLB, de grote omvang van de DIB ontmoedigen patch-clampers toe te passen voor het bestuderen van één-kanaals huidige opnames met gebruikelijke middelgrote huidgeleiding heeft gemaakt (< 100 pS).

Om te omzeilen de achtergrondgeluiden, moet het dubbelgelaagde gebied worden geminimaliseerd. Deze kwestie roept de herhalingen van ervaring met het ontwikkelen van elektrofysiologische technieken voor lipide bilayers (Figuur 1). In de vroege dagen, werd een kleine dubbelgelaagde (1-30 µm in diameter) opgericht op het puntje van een pipet (tip-dip methode; Figuur 1 C) ^{21 , 22 , 23}, in plaats van met behulp van een vrijstaande dubbelgelaagde (~ 100 µm in diameter) op een hydrofobe septum in een kamer (Figuur 1B). De tip-dip methode toegestaan voor elektrische metingen met veel lagere achtergrond lawaai²⁴. Onze ervaringen met PLB^25,26, tip-dip^22,23,27, en patch-clamp^{28,29,30, 31} methoden leidde ons naar een nieuw idee van het vormen van lipide-bilayers met behulp van de beginselen van de water-in-olie dubbelgelaagde. Wij hebben dit als de contact zeepbel dubbelgelaagde (CBB) methode^20,32genoemd. Bij deze methode in plaats van de waterdruppels opknoping in een olie-fase (Figuur 1D), een zeepbel van water is geblazen uit een glazen pipet (met tip diameter van ongeveer 30 µm) in de fase van de olie (Figuur 1E en 2), waar de Bubble wordt onderhouden door een constante druk uit te oefenen. Een enkelgelaagde vormen spontaan op het grensvlak water / olie op het oppervlak van de zeepbel. Vervolgens twee bubbels zijn gekoppeld door middel van de manipulatie van twee pipetten van glas en de dubbelgelaagde wordt gevormd als de twee monolayers aanpak elkaar, een evenwicht dubbelgelaagde gebied oplevert. De grootte van de bel wordt bepaald door de druk van de intra-bubble (holding druk), en eveneens de dubbelgelaagde grootte. Een gemiddelde diameter van 50 µm wordt vaak gebruikt. Hoewel het volume van de zeepbel klein is (< 100 pL), deze is aangesloten op het grotere volume van de pipet-oplossing die in het bereik van microliter, vormen de bulk elektrolyt fase.

Er zijn vele voordelen aan het gebruik van de methode CBB (tabel 1). Als een lipide dubbelgelaagde vorming techniek, membranen van verschillende lipide composities kunnen worden geproduceerd, en asymmetrische membranen zijn gemakkelijker gevormde³² dan die van de conventionele vouwen methode³³. De dubbelgelaagde kan mechanisch worden gemanipuleerd, in tegenstelling tot de conventionele PLB die alleen kan worden gebogen met een hydrostatische druk verschil^34,35. Door het veranderen van de druk van het bedrijf, de bubbels of vergroten of verkleinen, wat leidt tot verhoogde of verminderde membraan spanning³². De dubbelgelaagde is mechanisch afneembaar in monolayers, vergelijkbaar met de freeze-fractuur techniek^36,37 van membranen in de morfologische studies, maar met de CBB, een manoeuvre maakt het mogelijk voor herhaalde loskoppelen en hechten cycli³² . De geringe omvang van de elektrolyt oplossing binnen de zeepbel staat efficiënte fusie van kanaal-gereconstitueerd liposomen in de dubbelgelaagde, en de kans op het krijgen van kanaal opnamen is veel hoger dan bij de conventionele PLB techniek. Het kleine Bel volume kunt snelle perfusie (binnen ~ 20 ms) ook eens een ander injectie Pipet is ingevoegd in een van de bubbels. In tegenstelling tot de methode van de patch-clamp, zodra gebroken, een membraan CBB opnieuw onmiddellijk en herhaaldelijk wordt gevormd en pipetten meerdere malen per dag kunnen worden gebruikt. Voordelen van de patch-clamp en PLB methoden te integreren, biedt de CBB een veelzijdig platform om te variëren van de fysisch-chemische voorwaarden van het membraan, waardoor voor ongekende studies van kanaal-membraan interacties.

Vóór de presentatie van een gedetailleerd protocol van het proces van de vorming van CBB, wordt de fysicochemische achtergrond van de vorming van dubbelgelaagde eerste, die nuttig zijn voor patch-clampers op te lossen van experimentele moeilijkheden met betrekking tot de vorming van het membraan gepresenteerd die worden aangetroffen.

CBB experimenten geven lessen voor Oppervlaktechemie wetenschap³⁸. Het CBB is vergelijkbaar met een zeepbel geblazen uit een rietje in de lucht, waar ook een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel. Men zal merken dat een zeepbel water nauwelijks wordt opgeblazen wanneer membraan lipiden niet in de water-zeepbel of de organisch oplosmiddel opgenomen zijn. Bij gebrek aan amphipathic lipiden, de oppervlaktespanning bij een water-olie-interface is hoog, en de druk van de intra-bubble voor een zeepbel blazen hoog zal zijn. Dit is een realisatie van de Laplace-vergelijking (ΔP = 2 γ/R, waarbij ΔP de druk van de intra-bubble, γ is de oppervlaktespanning en R de straal van de zeepbel is). Wanneer de concentratie van lipiden in de organische fase of de elektrolyt oplossing hoog is, de dichtheid van lipiden in de enkelgelaagde toeneemt, zoals gedicteerd door de adsorptie-isotherm van Gibbs (-dγ = Γ_ik dµ_ik, waar Γ_ik de oppervlakte overmaat is van samengestelde i en µ_ik is de chemische potentiaal van component ik)³⁹, wat leidt tot een lagere oppervlaktespanning en gebruiksgemak luchtbel vorming. In het CBB, de dubbelgelaagde kan worden waargenomen vanuit een tangentiële hoek (Figuur 2) en is de contacthoek tussen de enkelgelaagde en dubbelgelaagde meetbaar. Deze hoek vertegenwoordigt een evenwicht tussen de surface tensions van de enkelgelaagde en dubbelgelaagde (jonge vergelijking: γ_bi = γ_ma cos(θ), waar γ_bi is de spanning dubbelgelaagde γ_ma is de enkelgelaagde spanning en θ is de contacthoek). De veranderingen in de contacthoek geven wijzigingen in de dubbelgelaagde spanning, gezien het feit dat de enkelgelaagde spanning uit veranderingen in de contacthoek wordt geëvalueerd als een functie van de membraanpotentiaal (Young-Lippmann vergelijking: γ_mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) – cos (θ_v)), waar C_m de capaciteit van de membraan is, V de membraanpotentiaal is en θ₀ en θ_v de contacthoeken op 0 en V mV, respectievelijk zijn)^{40,41 ,42}. Wanneer twee bubbels dicht genoeg zijn, benaderen ze elkaar spontaan. Dit is te wijten aan de van der Waals force, en wij kunnen dit dynamisch proces in CBB vorming visueel waarnemen.

Een CBB systeem bestaat uit verschillende fasen: namelijk een bulk olie fase, water van bubbels bekleed met een enkelgelaagde, en een contactmogelijkheden dubbelgelaagde (Figuur 3). Deze doen denken aan de meerdere fasen waargenomen in een PLB, zoals een oplosmiddel-houdende torus rond de dubbelgelaagde fase en een dunne organische fase ingeklemd door twee monolayers^43,44. In het CBB, de enkelgelaagde fase is continu met de dubbelgelaagde bijsluiter en lipide moleculen diffuus gemakkelijk tussen de enkelgelaagde en de bijsluiter. De enkelgelaagde fase behandelt de meeste van het oppervlak van de zeepbel, vormen de belangrijke werkfase die als een lipide-reservoir fungeert. Omdat de hydrofobe staart van lipiden in de enkelgelaagde zich naar buiten tot de bulk olie fase uitstrekt, opent de dubbelgelaagde interieur of de hydrofobe kern voor de bulk olie fase. Een hydrofobe stof ingespoten in de olie-fase dichtbij de dubbelgelaagde is dus gemakkelijk toegang krijgen tot het dubbelgelaagde interieur. Dit is het membraan perfusie techniek dat we hadden ontwikkeld onlangs⁴⁵, waarmee de samenstelling van lipide in de dubbelgelaagde snel (binnen een seconde) wordt gewijzigd tijdens één-kanaals huidige opnames. We vonden dat de cholesterol-gehalte in de dubbelgelaagde omkeerbaar kan worden gecontroleerd door het overschakelen van de cholesterol-perfusie, in- en uitschakelen⁴⁵. In het geval dat de concentratie van de betrokken stof in de enkelgelaagde en dubbelgelaagde verschilt, wordt het verloop van de concentratie van de betrokken stof onmiddellijk ontbonden door diffusie, die bekend als de Marangoni effect^46, staat ⁴⁷. anderzijds, slippers over de monolayers zijn traag^48,49,50.

Met behulp van de methode van het CBB, de dubbelgelaagde wordt gevormd onder veelzijdige fysisch-chemische omstandigheden, zoals een elektrolyt pH zo laag als 1 ⁵¹, een concentratie zout (K⁺nb⁺, enz.) tot 3 M, een zo hoog als ±400 mV membraanpotentiaal en een systeem temperatuur tot 60 ° c.

Er zijn verschillende opties voor de vorming van het CBB en opneming van kanaal moleculen daarin. Voor de vorming van de enkelgelaagde op het grensvlak water / olie, zijn lipiden toegevoegd in een organisch oplosmiddel (lipide-out methode; Figuur 4 A, 4 C) of in een zeepbel als liposomen (lipide-in methode; Figuur 4 B, 4 D). Met name zorgt de lipide-in-methode voor de vorming van asymmetrische membranen^15,32. Kanaal moleculen oplosbaar in waterige oplossing (bijvoorbeeld, kanaal-vormende peptiden) worden direct toegevoegd in de zeepbel (Figuur 4A, B)^52,53, overwegende dat kanaal eiwitten zijn gereconstitueerd in liposomen, die vervolgens worden toegevoegd in de zeepbel (Figuur 4C, D). Hierin, de vorming van CBBs door de methode lipide-in voor ofwel een kanaal peptide (polytheonamide B (pTB); Figuur 4 A) of een eiwit (KcsA kalium kanaal, Figuur 4C) wordt weergegeven.

Protocol

1. Prepareer liposomen Dispergeren fosfolipiden (bijv, 10 mg in poedervorm) in chloroform op een gewenste concentratie (bijv, 10 mg/mL). Verdampen chloroform. Plaats de fosfolipide oplossing in een rondbodemkolf en reeks het op een rotatieverdamper (Zie Tabel van materialen) op een gasfles van N2 aangesloten . Draai de erlenmeyer onder N2 stroom bij kamertemperatuur totdat een dunne fosfolipide film (na ~ 30 min verschijnt). P…

Representative Results

Een typische CBB had een diameter van 50 µm (Figuur 56) en de capaciteit van de specifieke membraan in hexadecaan was 0,65 µF/cm2. De belgrootte werd willekeurig gecontroleerd door de druk van de intra-bubble. Als kleine bellen nodig voor ruisarme opnamen zijn, moet de tip diameter dienovereenkomstig klein. Bijvoorbeeld, voor een belgrootte van 50 µm in diameter moet de tip diameter 30 µm. <p class="jove_content" fo:keep-to…

Discussion

De methode van het CBB van lipide dubbelgelaagde formatie is gebaseerd op het beginsel van een water-in-olie-droplet omzoomd door een enkelgelaagde²⁰. Technisch, zijn de procedures voor de vorming van CBBs eenvoudig, vooral voor patch-clamp onderzoekers, die bedreven zijn in het manipuleren van glas micropipetten. Het elektrofysiologische setup voor de patch-clamp is gemakkelijk in het CBB gebruikt wanneer twee Pipetteer manipulators met microinjectors beschikbaar zijn. Aan de andere kant, omdat h…

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100