Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.

Abstract

Lipid Bilayer bieten eine einzigartige experimentelle Plattform für funktionelle Studien der Ionenkanäle, so dass die Prüfung des Kanal-Membran Interaktionen unter verschiedenen Membran Lipid-Kompositionen. Unter anderem hat die Tröpfchen Schnittstelle Bilayer Popularität gewonnen; die große Membran Größe behindert jedoch die Aufzeichnung der elektrischen geringes Grundrauschen. Wir haben festgestellt, dass ein Kontakt Blase Bilayer (CBB)-Methode, die die Vorteile der planaren Lipid Bilayer verbindet und Patch-Clamp-Methoden, wie die Fähigkeit der Lipidzusammensetzung variieren und die Mechanik Bilayer bzw. zu manipulieren. Mit dem Setup für herkömmlichen Patch-Clamp-Experimenten, können CBB-basierten Experimente leicht durchgeführt werden. Kurz gesagt, eine Elektrolyt-Lösung in einer Glaspipette wird in einem organischen Lösungsmittel-Phase (Hexadecan) geblasen, und die Pipette Druck beibehalten wird, um eine stabile Blasengröße zu erhalten. Die Blase ist spontan eine Lipid-Monolayer (reine Lipide oder gemischte Lipide), gesäumt von Liposomen in den Bläschen vorsah. Als nächstes werden die beiden Monolage gesäumten Bläschen (~ 50 µm im Durchmesser) an der Spitze der Glaspipetten für Bilayer Bildung angedockt. Einführung von Kanal rekonstituiert Liposomen in die Blase führt zu die Einbeziehung der Kanäle in der Bilayer, zulassend Einkanal-aktuelle Aufnahme mit einem Signal-Rausch-Verhältnis des Patch-Clamp-Aufnahmen vergleichbar. CBBs mit einem asymmetrischen Lipidzusammensetzung sind leicht gebildet. Der CBB ist wiederholt durch Ausblasen der früheren Bläschen und bilden neue erneuert. Verschiedene chemische und physikalische Störungen (z.B., Membran-Perfusion und Bilayer Spannung) auf die CBBs. hierin auferlegt werden können, präsentieren wir Ihnen das grundlegende Verfahren für CBB Bildung.

Introduction

Für Ionenkanäle ist die Zellmembran nicht einfach ein unterstützendes Material, sondern als Partner für die Erzeugung des Ionen-Fluss. Funktional, die Membran ist ein elektrischer Isolator, in welche, den Ionen Kanäle eingebettet sind, und aller Zellmembranen sind mit einem ruhenden Membranpotential vermittelt. Konventionell, wurde eine willkürliche Membranpotential aus einem Außenkreis verhängt mit dem elektrischer Strom durch die Kanäle gemessen wurde. Diese quantitative Auswertung der Ionen-Fluss an verschiedenen Membran Potenziale offenbart die molekularen Eigenschaften dieser Kanäle, wie ihre ionenselektive Permeation und gating Funktionen^1,2. Die Membran-Plattform für funktionelle Studien von Ionenkanälen ist die Zellmembran oder Bilayer Lipidmembran. Historisch, Einkanal-elektrische aktuelle Aufnahmen wurden uraufgeführt im Lipid Bilayer^3,4, und die einschlägigen Techniken wurden entwickelt, um Zelle Membranen, wie der Patch-Clamp-Methode (Abbildung 1A )^5,6. Seitdem haben sich diese beiden Techniken separat für verschiedene Zwecke (Abbildung 1)^7,8entwickelt.

Membranlipide und Bilayer Membranen stehen derzeit im Mittelpunkt der Forschung für ihre Rolle bei der Unterstützung der Struktur und Funktion von Kanalproteinen. Daher ist die sofortige Verfügbarkeit von Methoden, um die Lipidzusammensetzung in Bilayer variieren stark nachgefragt. Lipid Bilayer Bildung Methoden wie die planare Lipid Bilayer (PLB)^8,9,10,11, Wasser-in-Öl Tröpfchen Bilayer¹²und Tröpfchen Schnittstelle Bilayer (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} Techniken (Abbildung 1) sind allgemeine Wahlen, bietet eine Möglichkeit für die Prüfung unter variierenden Lipid Kompositionen²⁰-Kanal-Funktion. Obwohl die DIB technisch wesentlich einfacher ist zu produzieren als die herkömmlichen PLB, die Größe des DIB schuf ein Abschreckungsmittel für Patch-reckenden anwenden für das Studium Einkanal-aktuelle Aufnahmen mit üblichen mittleren Leitwert (< 100 pS).

Um die Geräuschkulisse zu umgehen, muss der Bilayer Umgebung minimiert werden. Dieses Problem, erinnert sich die Wiederholungen der Geschichte bei der Entwicklung von elektrophysiologischer Techniken für Lipid Bilayer (Abbildung 1). In den frühen Tagen bildete sich eine kleine Bilayer (1-30 µm im Durchmesser) an der Spitze der Pipette (Tipp-Dip-Methode; Abbildung 1 ( C) ^{21 , 22 , 23}, anstatt mit einem freistehenden Bilayer (~ 100 µm im Durchmesser) auf eine hydrophobe Septum in einer Kammer (Abbildung 1B). Die Tipp-Dip-Methode für elektrische Messungen mit viel niedrigeren Hintergrund Lärm²⁴zulässig. Unsere Erfahrungen mit der PLB-^25,26, Tipp-Dip^22,23,27und Patch-Clamp^{28,29,30, 31} -Methoden führte uns auf eine neue Idee von Lipid Bilayer mit den Grundsätzen der Wasser-in-Öl-Bilayer bildet. Wir haben dies als Kontakt Blase Bilayer (CBB) Methode^20,32bezeichnet. Bei dieser Methode anstatt hängen die Wassertropfen in einer Ölphase (Abbildung 1D), eine Wasser-Blase wird geblasen aus einer Glaspipette (mit Durchmesser von ca. 30 µm) in die Ölphase (Abbildung 1E und 2), wo die Blase wird durch einen stetigen Druck aufrechterhalten. Spontan an der Wasser-Öl-Schnittstelle an der Oberfläche der Blase bildet sich eine Monolage. Dann zwei Seifenblasen durch die Manipulation von zwei Glaspipetten angedockt sind, und die Bilayer bildet sich nähern die beiden Monolagen einander, einen Gleichgewicht Bilayer Bereich nachgeben. Die Größe der Blase wird durch den Intra-Blase Druck (Nachdruck), und ebenso die Bilayer Größe gesteuert. Ein Durchmesser von 50 µm wird häufig verwendet. Obwohl das Volumen der Blase klein ist (< 100 pL), Anschluss an das größere Volumen der Pipette-Lösung, die im Bereich Mikroliter, bilden die Bulk-Elektrolyt-Phase ist.

Es gibt viele Vorteile, die CBB-Methode (Tabelle 1) zu verwenden. Als Lipid Bilayer Bildung Technik Membranen der verschiedenen Lipid-Kompositionen herstellbar und asymmetrische Membranen sind leichter gebildeten³² , als die von herkömmlichen klappbare Methode³³sind. Die Bilayer kann mechanisch bearbeitet werden, im Gegensatz zu den herkömmlichen PLB, die nur mit einem hydrostatischen Druck Unterschied^34,35gebogen werden kann. Durch die Veränderung der Nachdruck, die Luftblasen erweitern oder verkleinern, was zu erhöhten oder verringerten Membran Spannung³². Die Bilayer ist mechanisch abnehmbar in Monolayer, ähnlich wie die Freeze-Fraktur Technik^36,37 der Membranen in den morphologischen Studien, aber mit der CBB ermöglicht eine Manöver wiederholt trennen und anfügen Zyklen³² . Das geringe Volumen der Elektrolyt-Lösung innerhalb der Blase ermöglicht effiziente Mischung aus Kanal rekonstituiert Liposomen in der Bilayer, und die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens Kanal Aufnahmen ist viel höher als bei der konventionellen PLB-Technik. Das kleine Blase Volumen ermöglicht schnelle Perfusion (innerhalb von ~ 20 ms) auch einmal eine weitere Injektion Pipette wird entweder der Bläschen eingelegt. Im Gegensatz zur Patch-Clamp-Methode einmal gebrochen, eine CBB-Membran ist neu formiert, sofort und immer wieder, und Pipetten können mehrmals täglich verwendet werden. Durch die Integration Vorteile der Patch-Clamp und PLB Methoden, bietet der CBB eine vielseitige Plattform um die physikalisch-chemischen Bedingungen der Membran variieren für noch nie dagewesene Studien von Kanal-Membran Interaktionen ermöglicht.

Vor der Präsentation eines detaillierten Protokolls der CBB-Entstehungsprozess, ist physikalisch-chemischen Hintergrund der Bilayer Bildung zunächst dargestellt, die hilfreich für Patch-reckenden experimentelle Schwierigkeiten in Bezug auf die Membran Bildung behoben werden Das sind anzutreffen.

CBB Experimente vermitteln Lektionen der Oberflächenchemie Wissenschaft³⁸. Der CBB ist ähnlich wie eine Seifenblase geblasen aus einem Strohhalm in die Luft, wo ebenfalls, eine Wasser-Blase in einem organischen Lösungsmittel geblasen. Man wird feststellen, dass eine Wasser-Blase kaum aufgeblasen wird, wenn Membranlipide nicht in das Wasser-Blase oder dem organischen Lösungsmittel enthalten sind. Bei fehlender amphipathische Lipide die Oberflächenspannung an einer Wasser-Öl-Schnittstelle ist hoch, und der Intra-Blase Druck für eine Seifenblase wird hoch sein. Dies ist eine Erkenntnis der Laplace-Gleichung (ΔP = 2 γ/R, wo ΔP ist der Druck, Intra-Blase, γ ist Oberflächenspannung und R ist der Blasenradius). Wenn die Konzentration von Lipiden in der organischen Phase oder der Elektrolytlösung hoch ist, erhöht die Dichte der Lipide in der Monolage, wie von Gibbs Adsorption Isotherm diktiert (-Dγ = Γ_ich Dµ_ich, wo Γ_ich die Oberfläche Selbstbeteiligung ist der Verbindung i und µ_ich ist das chemische Potential der Komponente ich)³⁹, führt zu einer niedrigeren Oberflächenspannung und Leichtigkeit der Blasenbildung. In der CBB das Bilayer beobachtet werden, von einem tangentialen Winkel (Abbildung 2), und des Kontaktwinkels zwischen der Monolage und Bilayer messbar. Dieser Winkel stellt ein Gleichgewicht zwischen den Surface tensions der Monolage und Bilayer (junge Gleichung: γ_Bi = γ_Mo cos(θ), wo γ_Bi ist die Bilayer Spannung, γ_Mo ist die Monolayer-Spannung und θ ist der Kontaktwinkel). Die Änderungen in der Kontaktwinkel zeigen Veränderungen in der Bilayer Spannung, angesichts der Tatsache, dass die Monolayer-Spannung als Funktion des Membranpotentials von Änderungen in der Kontaktwinkel ausgewertet wird (Young-Lippmann Gleichung: γ_Mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) – cos (θ_V)), wo C_m die Membran Kapazität ist V das Membranpotential ist und θ₀ und θ_V jeweils der Kontaktwinkel auf 0 und V mV sind)^{40,41 ,42}. Wenn zwei Bläschen nah genug sind, gehen sie einander spontan. Dies ist aufgrund der Van-Der-Waals-Kraft, und wir können visuell beobachten dieser dynamischen Prozess in CBB-Formation.

Ein CBB-System besteht aus verschiedenen Phasen: nämlich ein Großteil Ölphase, Wasser Bläschen mit einem monomolekularen Film und eine Kontaktaufnahme mit Bilayer (Abbildung 3) beschichtet. Diese ähneln der mehrere Phasen in einem PLB, z. B. eine lösemittelhaltige Torus um die Bilayer-Phase und eine dünne organische Phase eingeklemmt durch zwei Monolagen^43,44beobachtet. In der CBB Monolayer-Phase ist kontinuierlich mit der Bilayer Broschüre und Lipidmoleküle leicht diffundieren zwischen der Monolage und die Packungsbeilage. Die Monolayer-Phase umfasst einen Großteil der Blase Oberfläche, bilden die Hauptphase, die als ein Lipid-Reservoir dient. Weil das hydrophobe Ende der Lipide in der Monolage erstreckt sich nach außen auf die Masse Ölphase, öffnet Bilayer Interieur oder die hydrophoben Kern der Masse Ölphase. Somit ist eine hydrophobe Substanz injiziert in die Ölphase in der Nähe der Bilayer Bilayer Innenraum leicht zugreifen. Dies ist die Membran Perfusion Technik, die wir kürzlich⁴⁵, entwickelt hatte, durch die die Lipidzusammensetzung in der Bilayer schnell (innerhalb einer Sekunde) bei Einkanal-aktuelle Aufnahmen geändert. Wir fanden, dass der Cholesteringehalt in der Bilayer reversibel durch die Cholesterin-Durchblutung an und Ausschalten⁴⁵gesteuert werden konnte. Den Fall, dass die Konzentration des betreffenden Stoffes in der Monolage und Bilayer unterscheidet, ist das Konzentrationsgefälle des betreffenden Stoffes sofort durch Diffusion, aufgelöst bekannt als der Marangoni Effekt^{46, 47}. auf der anderen Seite sind Flip-flops über die Monolagen langsam^48,49,50.

Bei der CBB-Methode der Bilayer bildet sich unter vielseitigen physikalisch-chemischen Bedingungen, wie ein Elektrolyt pH-Wert so niedrig wie 1 ⁵¹, eine Konzentration von Salz (K⁺, Na⁺)bis zu 3 M, ein Membran-Potential so hoch wie ±400 mV und ein System bis zu 60 ° c.

Es gibt mehrere Optionen für die Bildung der CBB und Einbeziehung der Kanal Moleküle darin. Für Bildung von der Monolage an der Wasser-Öl-Schnittstelle sind Lipide hinzugefügt, entweder in einem organischen Lösungsmittel (Lipid-Out-Methode; Abbildung 4 A, 4 C) oder in einer Blase als Liposomen (Lipid-Methode; Abbildung 4 ” B, 4D). Insbesondere kann die Lipid-Methode für die Bildung von asymmetrischen Membranen^15,32. Kanal-Moleküle in wässriger Lösung (z.B. Kanal bilden Peptide) löslich werden direkt in die Blase (Abbildung 4A, B)^52,53, hinzugefügt, während Kanalproteinen in wieder hergestellt werden Liposomen, die dann in die Blase (Abbildung 4C, D) hinzugefügt werden. Hierin, die Bildung von CBBs durch das Lipid-in-Verfahren für entweder ein Kanal-Peptid (Polytheonamide B (pTB); Abbildung 4 ( A) oder ein Protein (KcsA Kaliumkanal, Abbildung 4C) angezeigt wird.

Protocol

1. bereiten Sie Liposomen Phospholipide (z.B. 10 mg Pulver) im Chloroform bei einer gewünschten Konzentration (z.B. 10 mg/mL) auflösen. Verdunsten Sie Chloroform. Ort der Phospholipid-Lösung in ein Rundboden Kolben und es auf einen Drehverdampfer (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Gasflasche N2 verbunden. Drehen Sie die Flasche unter N2 fließen bei Raumtemperatur bis ein dünne Phospholipid-Film (nach ~ 30 min) erscheint….

Representative Results

Eine typische CBB hatte einen Durchmesser von 50 µm (Abbildung 56) und die spezielle Membran-Kapazität im Hexadecan war 0,65 µF/cm2. Die Blasengröße wurde willkürlich durch die Intra-Blase Druck gesteuert. Wenn Bläschen für rauscharme Aufnahmen notwendig sind, sollte der Kopfkreis entsprechend klein sein. Beispielsweise sollte der Kopfkreis für eine Blasengröße von 50 µm im Durchmesser, 30 µm. <p class="jove_conten…

Discussion

Die CBB-Methode von Lipid Bilayer Bildung basiert auf dem Prinzip eines Wasser-in-Öl-Tropfens, gesäumt von einem monomolekularen Film²⁰. Technisch sind die Verfahren zur Bildung von CBBs einfach, vor allem für Patch-Clamp-Forscher, die Manipulation von Glas Mikropipetten beherrschen. Die elektrophysiologische Setup für die Patch-Clamp ist leicht in der CBB verwendet, wenn zwei Pipette Manipulatoren mit Microinjectors verfügbar sind. Auf der anderen Seite, weil der CBB ein Nachfolger der herk?…

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100