Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Abstract

Bilayers do lipid fornecem uma única plataforma experimental para estudos funcionais de canais iônicos, permitindo que o exame das interações de canal-membrana sob a membrana várias composições de lipídios. Entre eles, a BICAMADA de interface da gota ganhou popularidade; no entanto, o tamanho grande membrana dificulta a gravação do ruído de fundo eléctrica baixa. Nós temos estabelecido um método de BICAMADA (CBB) contato bolha que combina os benefícios da bicamada lipídica planar e remendo-braçadeira métodos, tais como a capacidade de variar a composição de lipídios e manipular a mecânica de BICAMADA, respectivamente. Usando a configuração para experimentos de remendo-braçadeira convencional, CBB-baseado podem ser prontamente realizados experimentos. Em breve, uma solução de eletrólito em uma pipeta de vidro é fundida em uma fase de solvente orgânica (hexadecano) e a pressão da pipeta é mantida para obter um tamanho de bolha estável. A bolha é espontaneamente forrada com uma monocamada de lipídios (lipídios puros ou mistos de lipídios), que é fornecida de lipossomas nas bolhas. Em seguida, as duas bolhas de monocamada-alinhado (~ 50 µm de diâmetro) na ponta da pipeta de vidro são encaixadas para formação da bicamada. Introdução do canal-reconstituído lipossomas dentro da bolha leva à incorporação de canais na BICAMADA, permitindo a gravação atual de canal único com uma relação sinal-ruído comparável de gravações de remendo-braçadeira. CBBs com uma composição assimétrica lipídios formam-se facilmente. A CBB é renovada repetidamente por estourar as bolhas anteriores e formando novos. Várias perturbações físicas e químicas (por exemplo, perfusão de membrana e a BICAMADA tensão) podem ser impostas a CBBs. aquiem, apresentamos o procedimento básico para formação da CBB.

Introduction

Para canais de íon, a membrana celular não é simplesmente um material de apoio, mas um parceiro para gerar o fluxo de íons. Funcionalmente, a membrana é um isolador elétrico, no qual íon canais são incorporados, e todas as membranas celulares são transmitidas com um potencial de membrana de repouso. Convencionalmente, um potencial de membrana arbitrária foi imposta de um circuito externo pelo qual a corrente elétrica através dos canais foi medido. Esta avaliação quantitativa do fluxo de iões em potenciais de membrana diferentes revelou as propriedades moleculares destes canais, tais como sua permeação íon-seletivo e associada funções^1,2. Plataforma para estudos funcionais de canais iônicos de membrana é a membrana celular ou membrana de bicamada lipídica. Historicamente, gravações de corrente elétricas monocanal realizaram-se primeiro no lipid bilayers^3,4, e as técnicas pertinentes foram desenvolvidas para as membranas celulares, tais como o método de remendo-braçadeira (Figura 1A )^5,6. Desde então, estas duas técnicas evoluíram separadamente para fins diferentes (Figura 1)^7,8.

Lipídios de membrana e membranas de BICAMADA são atualmente o foco de pesquisa para os seus papéis no apoio a estrutura e função das proteínas de canal. Portanto, a pronta disponibilidade de métodos para variar a composição lipídica em bilayers está em alta demanda. Métodos de formação de bicamada lipídica como a planar lipídios BICAMADA (PLB)^8,9,10,11, gotículas de água em óleo BICAMADA¹²e gota interface BICAMADA (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 ,} técnicas de ¹⁹ (Figura 1) são escolhas comuns, fornecendo uma oportunidade para examinar a função canal sob diferentes composições de lipídios²⁰. Embora o DIB é tecnicamente muito mais fácil de produzir do que a convencional PLB, o grande tamanho de DIB criou um desincentivo para remendo-clampers para aplicá-la para o estudo atuais gravações de canal único com tamanho usual de condutância (< 100 picosegundo).

Para contornar o ruído de fundo, a área de BICAMADA deve ser minimizada. Esta questão recorda as repetições da história no desenvolvimento de técnicas eletrofisiológicas para bilayers do lipid (Figura 1). Nos primeiros dias, formou-se uma BICAMADA de pequeno porte (1-30 µm de diâmetro) na ponta de uma pipeta (método de imersão a dica; Figura 1 C) ^{21 , 22 , 23}, em vez de usar uma BICAMADA autônoma (~ 100 µm de diâmetro) em um septo hidrofóbico em uma câmara (Figura 1B). O método de imersão a ponta permitido para medições elétricas com muito de ruído de fundo inferior²⁴. Nossas experiências com o PLB^25,26, ponta-mergulho^22,23,27e remendo-braçadeira^28,29,30, métodos de ³¹ nos levaram a uma nova ideia de formar bilayers do lipid usando os princípios da bicamada de água em óleo. Referimos a isto como o contato bolha BICAMADA (CBB) método^20,32. Neste método, ao invés de pendurar as gotículas de água em uma fase de óleo (Figura 1D), uma bolha de água é levada de uma pipeta de vidro (com diâmetro de ponta de cerca de 30 µm) para a fase de óleo (Figura 1E e 2), onde o bolha é mantida através da aplicação de uma pressão constante. Um forms monocamada espontaneamente na interface água-óleo na superfície da bolha. Em seguida, duas bolhas são encaixadas através da manipulação de duas pipetas de vidro, e a BICAMADA é formada como as duas monocamadas aproximam uns aos outros, com uma área de BICAMADA de equilíbrio. O tamanho da bolha é controlado pela pressão intrabolha (mantendo a pressão) e, da mesma forma, o tamanho da bicamada. Diâmetro médio de 50 µm é frequentemente usado. Embora o volume da bolha é pequeno (< 100 pL), está relacionado com o maior volume da solução de pipeta que é na faixa de microlitros, constituindo a fase de eletrólito em massa.

Há muitos benefícios de usar o método da CBB (tabela 1). Como uma técnica de formação de bicamada lipídica, membranas de várias composições de lipídios podem ser produzidas, e membranas assimétricas são mais prontamente formado³² do que são aqueles pelo convencional método dobrável³³. A BICAMADA pode ser manipulada mecanicamente, ao contrário do PLB convencional que só pode ser dobrado com uma diferença de pressão hidrostática^34,35. Alterando a pressão de exploração, as bolhas ou expandir ou encolhem, levando ao aumento ou diminuição da membrana de tensão³². A BICAMADA é mecanicamente destacável em monocamadas, semelhantes a congelar-fratura técnica^36,37 das membranas em estudos morfológicos, mas com a CBB, uma manobra permite múltiplas desanexar e anexar ciclos³² . O pequeno volume da solução de eletrólito dentro da bolha permite fusão eficiente de lipossomas canal-reconstituído a BICAMADA, e a probabilidade de conseguir as gravações do canal é muito maior do que com a técnica convencional de PLB. O volume de pequena bolha também permite perfusão rápida (dentro de ~ 20 ms) injeção uma vez outra pipeta é inserida em qualquer das bolhas. Ao contrário do método de remendo-braçadeira, uma vez quebrado, uma membrana CBB é re-formada imediatamente e repetidamente, e pipetas podem ser usadas várias vezes ao dia. Integrando os benefícios da remendo-braçadeira e métodos PLB, a CBB fornece uma plataforma versátil para variar as condições físico-químicas da membrana, permitindo estudos sem precedentes de interações de canal-membrana.

Antes de apresentar um protocolo detalhado do processo de formação de CBB, o fundo físico-químico da formação BICAMADA é apresentado primeiro, que será útil para remendo-clampers resolver dificuldades experimentais relacionadas com a formação da membrana que são encontrados.

Experimentos CBB dar aulas de química de superfície ciência³⁸. A CBB é semelhante a uma bolha de sabão soprada de um canudo para o ar, onde da mesma forma, uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico. Um vai notar que uma bolha de água dificilmente é inflada quando lipídios de membrana não estão incluídos na bolha de água ou solvente orgânico. Na ausência de lipídios anfifílicos, a tensão de superfície em uma interface água-óleo é elevada, e a pressão intrabolha para explodir uma bolha vai ser alta. Esta é uma realização da equação de Laplace (ΔP = 2 γ/R, onde ΔP é a pressão intrabolha, γ é a tensão de superfície, e R é o raio da bolha). Quando a concentração de lipídios na fase orgânica ou a solução eletrolítica é elevada, aumenta a densidade dos lipídios na monocamada, conforme indicado pela isoterma de adsorção de Gibbs (-dγ = Γ_eu dµ_eu, onde Γ é o excesso de superfície do composto i e µ_eu é o potencial químico do componente eu)³⁹, levando a uma baixa tensão superficial e a facilidade de formação de bolhas. A CBB, a BICAMADA pode ser observada de um ângulo tangencial (Figura 2) e o ângulo de contato entre a monocamada e BICAMADA é mensurável. Este ângulo representa um equilíbrio entre a surface tensions da monocamada e BICAMADA (equação jovem: γ_bi = γ_mo cos(θ), onde γ_bi é a tensão de BICAMADA, γ_mo é a tensão de monocamadas e θ é o ângulo de contato). As alterações no ângulo contato indicam mudanças na tensão BICAMADA, dado que a tensão de monocamada é avaliada de alterações no ângulo de contato em função do potencial de membrana (equação de Young-Lippmann: γ_mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) – cos (θ_v)), onde C_m é a capacitância de membrana, V é o potencial de membrana e θ₀ e θ_v são os ângulos de contacto em 0 e V mV, respectivamente)^{40,41 ,},⁴². Quando duas bolhas estão perto o suficiente, eles se aproximam um do outro espontaneamente. Isto é devido a força van der Waals, e podemos observar visualmente este processo dinâmico na formação da CBB.

Um sistema CBB é composto por fases distintas: ou seja, uma fase de óleo em massa, revestidas com uma monocamada e uma contato BICAMADA (Figura 3) de bolhas de água. Estas são uma reminiscência das várias fases observadas em um PLB, tais como um toro que contenham solventes em torno da fase de BICAMADA e uma fase orgânica fina imprensado por duas monocamadas^43,44. A CBB, fase monocamada é contínua com o folheto do BICAMADA e moléculas lipídicas prontamente difundem entre a monocamada e o folheto. A fase de monocamada cobre a maior parte da superfície da bolha, constituindo a fase principal que serve como um reservatório de lipídios. Porque a cauda hidrofóbica de lipídios na monocamada se estende para fora para a fase de óleo em massa, o interior da bicamada ou o núcleo hidrofóbico abre a fase de óleo a granel. Assim, uma substância hidrofóbica injectada a fase de óleo perto da bicamada é capaz de acessar facilmente o interior da bicamada. Esta é a técnica de perfusão de membrana que tínhamos desenvolvido recentemente⁴⁵, pelo qual a composição de lipídios na BICAMADA mudou rapidamente (dentro de um segundo) durante gravações atuais de canal único. Nós achamos que o teor de colesterol na BICAMADA poderia ser reversível controlado por ligar a perfusão de colesterol e desligar⁴⁵. No caso em que a concentração da substância relevante na monocamada e bicapa difere, o gradiente de concentração da substância relevante é imediatamente dissolvido através da difusão, que é conhecido como o efeito de Marangoni^{46, 47}. por outro lado, flip-flops através de monocamadas são lento^48,,^49,50.

Usando o método da CBB, a BICAMADA é formada sob condições físico-químicas versáteis, como um pH de eletrólito tão baixo quanto 1 ⁵¹, uma concentração de sal (K⁺, Na⁺, etc.) até 3 M, um potencial de membrana tão alto quanto ±400 mV e um sistema de temperatura até 60 ° c.

Existem várias opções para a formação da CBB e a incorporação de moléculas de canal nele. Para a formação da monocamada na interface água-óleo, lipídios são adicionados em um solvente orgânico (método de lipídios-out; Figura 4 A, 4 C) ou em uma bolha como lipossomas (lipid-no método; Figura 4 B, 4 D). Notavelmente, o lipid-em método permite a formação de membranas assimétricas^15,32. Moléculas de canal solúveis em solução aquosa (por exemplo, canal-formando peptídeos) são adicionadas diretamente na bolha (Figura 4A, B)^52,53, Considerando que as proteínas de canal são reconstituídas em lipossomas, que são adicionados dentro da bolha (Figura 4C, D). Neste documento, a formação da CBBs pelo método lipid-para um peptide de canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) ou de uma proteína (canal de potássio KcsA, Figura 4C) é mostrada.

Protocol

1. prepare os lipossomas Disperse os fosfolípidos (por exemplo, 10 mg em pó) em clorofórmio em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mg/mL). Evapore o clorofórmio. Lugar a solução de fosfolípidos em um balão de fundo redondo e o conjunto em um evaporador rotativo (ver Tabela de materiais) conectado a um cilindro de gás de2 N. Gire o frasco sob fluxo de2 N à temperatura ambiente até um filme fino fosfolipídeo aparece (d…

Representative Results

Um típico CBB tinha um diâmetro de 50 µm (Figura 56), sendo a capacitância de membrana específicas em hexadecano 0.65 µF/cm2. O tamanho da bolha arbitrariamente era controlado pela pressão intrabolha. Quando pequenas bolhas são necessárias para as gravações de baixo ruído, o diâmetro da ponta deve ser correspondentemente pequeno. Por exemplo, para um tamanho de bolha de 50 µm de diâmetro, o diâmetro da ponta deve se…

Discussion

O método CBB de formação de bicamada lipídica é baseado no princípio de uma gota de água em óleo, revestida por uma monocamada de²⁰. Tecnicamente, os procedimentos para a formação de CBBs são fáceis, especialmente para os pesquisadores da remendo-braçadeira, que são proficientes em manipular Micropipetas de vidro. A configuração eletrofisiológica para a braçadeira do remendo prontamente é usada na CBB quando dois manipuladores de pipeta com microinjectors estão disponíveis. Po…

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100