Vi beskriver här ett protokoll för att undersöka cytotoxiciteten hos föraktiverade CD8+ T celler mot cancerceller genom att upptäcka apoptotiska cancer celler via realtid mikroskopi. Detta protokoll kan undersöka mekanismerna bakom myeloida cell-inducerad T cell dämpning och utvärdera föreningar som syftar till att påfyllning av T celler via blockad av suppressiv myeloisk immunceller.
Potentiering av tumör-dödande förmåga CD8+ T celler i tumörer, tillsammans med deras effektiva tumör infiltration, är en nyckelfaktor för framgångsrik immunterapier. Flera studier har visat att tumören infiltrerar myeloida celler (t.ex. myeloisk-derived suppressor-celler (MDSCs) och tumör-associerad makrofager (TAMs)) undertrycka cytotoxiciteten hos CD8+ T-celler i den tumör närmiljön och den inriktning dessa reglerande myeloida celler kan förbättra immunterapi. Här presenterar vi ett in vitro-test system för att utvärdera immun suppressiv effekterna av monocytic-MDSCs och TAMs på tumör-dödande förmåga CD8+ T celler. I detta syfte vi först odlade naiva mjälten CD8+ T celler med anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar i närvaro eller frånvaro av suppressor celler och samtidig odlade sedan föraktiverade T-cellerna med målet cancerceller i närvaro av en fluorogenic kaspas-3 substrat. Fluorescens från substratet i cancerceller upptäcktes av realtid fluorescensmikroskopi som en indikator på T-cell induceras tumör cell apoptos. I denna analys, kan vi identifiera ökningen av tumör cell apoptos av CD8+ T celler och dess bekämpande av före kultur med TAMs eller MDSCs. Denna funktionella analys är användbar för att undersöka CD8+ T cell undertryckande mekanismer av reglerande myeloida celler och identifierande druggable mål att övervinna det via high throughput screening.
Det är känt att CD8+ T celler kan eliminera tumörceller när de utövar sin fulla cytotoxicitet. Efter aktivering av T-cell receptor (TCR), CD8+ T celler föröka sig och differentiera till cytotoxiska effektor celler. Den utökade och aktiveras CD8+ T celler utsöndrar cytotoxiska granulat, inklusive perforin och granzymes, som överförs till målceller och initiera olika lytisk vägar såsom kaspas-3 medierad apoptos1. CD8+ T celler kan också inducera tumör cell apoptos genom att aktivera receptorer på målceller, såsom receptorer för tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), första apoptos signal ligand (FasL) eller TNF-relaterade apoptos-inducerande ligand (TRAIL). Dessutom den aktiveras CD8+ T celler utsöndrar interferon-γ (IFN-γ) som kan undertrycka tumör cell spridning och öka känsligheten för tumörcellerna att CD8+ T celler via Uppregleringen av FasL receptor1. Tanke på potentialen för CD8+ T tumör dödande förmåga, flera strategier för att öka deras cytotoxicitet (t.ex. checkpoint-hämmare, cancer vaccination och överföring av chimära antigen receptorn (bil) uttrycker T-celler) har fastställts och visat betydande terapeutiska effekter på vissa typer av cancer2. Ackumulerande bevis antyder dock att tumör-infiltrera immuna celler såsom regulatoriska T-celler, myeloid-derived suppressor celler (MDSCs) och tumör-associerad makrofager (TAMs) kan undertrycka CD8+ T cell funktioner och begränsa effekten immunterapier3,4,5. För att förbättra sådan immunterapier, det är viktigt att förstå hur immun suppressor celler gräns CD8+ T cell cytotoxicitet. Identifiering av CD8+ T cell undertryckande mekanismer samt druggable mål att övervinna det, krävs utveckling och utnyttjande av in vitro-analyser.
Guld standard metoden att mäta CD8+ T cell cytotoxicitet är krom utgåva analysen där utsläpp av radioaktiva sonden (51Cr), från målet celler som är lyserat av CD8+ T celler, är beslutsam6. Denna analys har dock flera nackdelar inklusive relativt låg känslighet, hög bakgrund, oförmåga att upptäcka tidiga apoptotiska händelser, farliga förfogande problem och begränsad kompatibilitet med automatiserad vätskehantering och upptäckt att stödja högre genomströmning applikationer. En annan vanlig metod är flödescytometrisk flödesanalyser där apoptos av målceller tumör upptäcks av annexin V bindande7. I denna analys är det möjligt att upptäcka andra parametrar såsom mål celldöd med propidium jodid (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) och effektor cellaktivering indikeras av CD107a eller CD69 uttryck, förutom apoptos i målcellerna7 . Denna analys kräver dock stort antal suppressor-celler jämfört med krom utgåva analysen. Det kräver också den lösgörande och uppdelning av vidhäftande målceller och detta kan snedvrida resultaten. Faktiskt, krom release assay eller flöde flödescytometrisk analys används inte ofta att undersöka suppressor cell effekter på T-cellfunktioner. I stället mätning av T-cell spridning anges genom utspädning av ett fluorescerande färgämne (t.ex. CFSE) förinstallerad i T-celler är ofta används för att utvärdera hämning av CD8+ T-cellsfunktion av suppressor celler. Identifiering av IFN-γ-produktion från odlade T-celler är en annan vanlig metod för att utvärdera effekterna av suppressor celler på T-cell aktivering8,9. Men resultaten från dessa analyser inte nödvändigtvis korrelerar till målcellen dödande förmåga av CD8+ T celler.
Vi presenterar här ett alternativt funktionellt test för att utvärdera effekterna av suppressor celler, särskilt makrofager i metastaserande tumörer, på cytotoxiciteten hos CD8+ T celler. Denna metod bestämmer cytotoxiciteten hos CD8+ T celler, pre odlade med eller utan suppressor cellerna i närvaro av anti-CD3/CD28 aktiverande antikroppar, genom att upptäcka tumör cell apoptos, indikeras av fluorescens från en fluorogenic kaspas-3 substratet6 använder automatiserad time-lapse mikroskopi (figur 1). Detta protokoll har flera fördelar jämfört med andra metoder. den kräver endast ett litet antal celler, möjliggör detektering av vidhäftande tumörcelldöd med hög känslighet, kan bilden effektor-to-target interaktion i realtid och är mottagliga för high throughput screening.
I detta protokoll används metastas-associerade makrofager (MAMs) och deras stamfader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isolerade från metastaserande tumörer hos möss som suppressor celler. I musmodeller av metastaserande bröstcancer, kännetecknas en distinkt befolkning av makrofager som F4/80högLy6G–CD11bhögLy6Clåg ackumuleras i lungan som innehåller metastaserande tumörer. Detta makrofag befolkningen sällan återfinns i den normala lungan och således kallas metastaser-associerade makrofager (MAMs)10. I dessa mus-modeller, en annan myeloisk cell befolkningen, definieras som F4/80högLy6G–CD11bhögLy6Chög, ackumuleras också huvudsakligen i metastaserande lungcancer där det ger upphov till MAMs11. Baserat på deras egenskaper, kan de CD11bhögLy6Chög MAM stamceller representera M-MDSCs12.
Denna metod är baserad på två separata samtidig kultur steg: samtidig odling CD8+ T celler med potentiella suppressor-celler, och samtidig odling av ‘konditionerade’ CD8+ T celler med målet tumörceller (figur 1). Det första steget för samtidig kultur är ganska liknande den för CD8+ T cell spridning analyser används vanligen för att bestämma effekten av suppressor celler på CD8+ T-cellsfunktion. Dock korrelerar T cell spridning inte alltid med deras cytotoxicitet. Exempelvis har vi funnit det samtidig kulturen med M-MDSCs eller MAMs ökade snarare än minskade spridningen av CD8+ T celler i närvaro av CD3/CD28 aktivera antikroppar (kompletterande figur 3), medan dessa pre luftkonditionerade CD8+ T-celler visat minskad cytotoxicitet mot målet cancerceller (figur 4, figur 5, figur 6). Dessa resultat betona vikten av utvärdering av funktionell aktivitet, framgår av målet cancer cell apoptos, erbjuds av denna CD8+ T cell cytotoxicitet analys.
I denna analys, vi har identifierat att CD8+ T celler kräver ca 15 h av samtidig kultur för att framkalla maximal apoptos av E0771-LG mus mjölkkörtlar tumörceller (figur 5). Denna försening kan bero på eftersläpning mellan första kontakten av effektor celler med mål och medföljande immun synaps bildas, samt tid som krävs för att framkalla apoptotiska signaler i mål mätt av aktivering av kaspas-3 (kompletterande film 1 ). Vi har även identifierat som antalet apoptotiska tumörceller nått en platå efter 24 h, vilket förmodligen beror på avskaffandet av mål av T-celler och/eller fluorescerande signalförlust från döda celler. Denna kapacitet att identifiera tiden av peak apoptos är en stor fördel med denna analys eftersom fastställandet av en optimal tidpunkt är viktigt för lämpliga jämförelser mellan olika förhållanden. I vårt fall till exempel skillnaden i cytotoxicitet mellan kontroll CD8+ T celler och MDSC/MAM-utbildas CD8+ T celler var mycket större på 15-18 h jämfört med 72 h (figur 5), och således en slutpunkt experimentera med en 72 h inkubationstid skulle ge missvisande resultat.
Denna metod gör det också möjligt för visualisering av realtid effektor-to-target cell interaktion, vilket skulle ge större insikter i mekanismen bakom begränsad cytotoxiciteten hos CD8+ T celler före inkuberas med suppressor celler. Till exempel, vi konstaterade att CD8+ T celler före inkuberas med M-MDSCs eller MAMs stött och interagerat med målet tumörceller men inducerade inte alltid apoptos (kompletterande film 4, kompletterande film 5, kompletterande film 6). Även om vi inte kvantifiera denna händelse, vore det genomförbart och intressant att kvantifiera och jämföra andelen möten och deras interaktion tid i samband med induktion av apoptos. En annan stor fördel är att den här metoden kräver ett litet antal celler (t.ex., 1 x 103 mål) och 4 x 103 effektor celler per brunn. I själva verket kan detta protokoll vara ytterligare miniatyriserade för plattan med 384 brunnar format om så önskas. Denna analys är därför lämplig för high throughput screening och experiment där cell nummer är begränsade som in vitro- tester med dyrbara celler härstammar från in vivo eller ex vivo prover.
Däremot, är en begränsning av nuvarande analysen förekomsten av betydande antal döda effektor celler i vissa förhållanden. För att öka träffsäkerheten i skilja apoptos mål cancerceller från det av effektor CD8+ T-celler, atomkärnor av målet celler är märkta och en nuclei storlek begränsning (som utesluter effektor celler) används för dataanalys i detta assay (figur 2). Det finns dock vissa fall där överlagring av aggregat av (gröna) apoptotiska CD8+ T celler till cancerceller icke-apoptotiska mål, som kan blanda ihop resultaten. Denna begränsning kan mildras genom användning av en död cell borttagning kolumn på effektor celler före samarbete kultur med målet tumörceller, förutsatt att tillräckligt antal effektor celler finns tillgängliga. Med mer komplexa mikroskopi system, kan det också vara möjligt att minska den falska positiva signalen genom märkning effektor CD8+ T celler med en fluorophore skiljer sig från målet cellen atomkärnor och fluorogenic kaspas-3 substrat.
Hittills har detta protokoll har använts för att undersöka antigen icke-specifik aktivering av CD8+ T celler. Även om MDSCs och TAMs i den tumör mikromiljö undertrycka T cellfunktioner genom antigen icke-specifika mekanismer, undertrycka MDSCs i perifera lymfoida vävnader T-cell svar i en antigen specifika sätt18. För att undersöka immun suppressiv funktioner sådana celltyper, en in vitro-spridning analys använder CD8 celler+ T från OT-1 transgena möss används ofta. I denna analys, OT-1 T-cellerna (uttrycker äggalbumin (OVA) specifik T-cells receptor) Co odlas med suppressor MDSCs i närvaro av OVA peptider, som är tillämpligt för den första kulturen i våra cytotoxicitet analys (i.e., aktivering av T-celler i närvaron eller frånvaron av dämpning). Det är också möjligt att manipulera mål cancerceller att uttrycka ägg, som kan framkalla antigen-specifika cancer cell dödande av OT-1 T-celler. Analysen möjliggör därför även utredning av MAM/MDSC-medierad dämpning av antigen-specifika T-cellsaktivering. Det är också möjligt att tillämpa den analysmetod för att undersöka mänskliga celler, aktiveringen antikroppar mot humant CD3 och CD28 är kommersiellt tillgängliga, och ett protokoll att isolera mänskliga TAMs från kliniska prover har varit etablerade19.
Sammantaget denna analys är ganska mångsidig och kan användas för att undersöka cytotoxiciteten hos andra immunceller typer. För närvarande i våra labb, det utvidgas för att undersöka antigen-beroende cell cytotoxicitet under olika förhållanden och är också utvecklas för high throughput screening.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) och MRC (herr/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC och DDS erkänner stöd från nationella fenotypiska Screening centrum Phenomics Discovery initiativ och Cancer Research UK (NOC)
0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells |
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells |
anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells |
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells |
Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
DAPI | Biolegend | 422801 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells |
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 – 480 nm : Green channel emission: 504 – 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 – 705 nm |