Подготовка Poly(pentafluorophenyl acrylate) функционализированных SiO2 бусины очищение протеина
Summary
Протокол для подготовки поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема бусины представлены. Функционализированных поверхность poly(PFPA) затем прикол с антителами и успешно используется для разделения белков через иммунопреципитации.
Abstract
Мы демонстрируем простой способ подготовить поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема Бусины для иммобилизации антитела и последующих иммунопреципитации (IP) приложения. Poly(PFPA) привитые поверхность готова через простой двухэтапный процесс. На первом шаге как компоновщик молекулы на поверхности кремния осаждается 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). На втором шаге, poly(PFPA) гомополимер, синтезированных через реверсивный сложения и фрагментации цепной передачи (РАФТ) полимеризации, является привитыми к молекуле компоновщик через реакции обмена между пентафторфенилгидразин (ПРМ) единиц на полимерные и амины группы на APTES. Осаждения APTES и poly(PFPA) на кремний частицы являются подтверждается Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS), а также контролируется изменения размера частиц измеряется через Динамическое рассеяние света (DLS). Для улучшения поверхности гидрофильность бусы, частичная замена poly(PFPA) с Амин функционализированных poly(ethylene glycol) также производится (амино PEG). ПЭГ замещенных poly(PFPA) привитые кремнезема, который бусины затем прикол с антитела для IP приложения. Для демонстрации занятых антитело против протеинкиназы РНК активированный (PKR), и эффективность IP определяется Западный blotting. Результаты анализа показывают, что бусины иммобилизованные антитела действительно может использоваться для обогащения PKR, в то время как неспецифический белковых взаимодействий являются минимальными.
Introduction
Реактивные полимерной щетки получили большой интерес в последние годы. Они могут быть использованы для иммобилизации функциональные молекулы органических или неорганических материалов для создания активированных поверхностей с приложениями в таких областях, как обнаружение и разделения1,2,3,4, 5. Среди полимеров сообщили содержащие пентафторфенилгидразин эфира единицы являются особенно полезными ввиду их высокой реактивности с аминами и стойкость к гидролизу6. Один из таких полимеров является poly(PFPA), и она может быть легко функционализированных после полимеризации с молекул, содержащих первичных или вторичных аминов7,8,9,10. Одним из примеров poly(PFPA) щетки были прореагировало с амино spiropyrans для создания поверхности свет отзывчивым7.
Подготовка poly(PFPA) и его приложений были описаны в ряде предыдущих публикаций6,,78,9,10,11,12 ,13,14,,1516,17. В частности Theato и коллеги сообщили синтез poly(PFPA) щетки через «прививки» и «прививки от «методы7,8,10,11,12 . В «прививки» подход, поли (methylsilsesquioxane)-поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(MSSQ-PFPA)) гибридный полимер был синтезированных8,10,,1112. Компонент poly(MSSQ) был в состоянии формы сильная адгезия с рядом различных органических и неорганических поверхностей, таким образом позволяя poly(PFPA) компонент для формирования кистью слой на поверхности с покрытием материала. В «прививки от «подход, поверхность начато реверсивные сложения и фрагментации цепной передачи (SI-плот) полимеризации был нанят подготовить poly(PFPA) щетки7. В этом случае агент передачи поверхности иммобилизованных цепи (SI-CTA) был впервые ковалентно присоединяется к подложке через кремний силана реакции. Иммобилизованных SI-CTA затем участвовала в SI-плот полимеризации мономеров Стихийного, генерации плотно упакованных poly(PFPA) щетки с стабильной ковалентная связь к подложке.
Используя кисти poly(PFPA), синтезированных через SI-плот полимеризации, мы недавно продемонстрировали иммобилизации антител на poly(PFPA) привитые частиц кремнезема и их последующего применения в очистки белков18. Использование poly(PFPA) щетки для иммобилизации антитело было обнаружено решить ряд вопросов, связанных с текущей разделение белков через IP. Обычные IP основывается на использовании белка A/G как компоновщик для антитела иммобилизации19,,2021. Поскольку использование белка A/G позволяет антитела к быть присоединен с конкретной ориентации, высокие цели антигена восстановления эффективность достигается. Однако использование белка A/G страдает от неспецифических белков взаимодействия, а также потеря антител при восстановлении белка, оба из которых способствуют высокий уровень фонового шума. Для устранения этих недостатков, прямые сшивки антител к твердой поддержки был изучены22,,23–24. Эффективность таких методов обычно низка из-за случайной ориентации crosslinked антителами. Для poly(PFPA) привитые субстрата иммобилизация антител является постоянным, благодаря реакции обмена между подразделениями ПРМ и Амин функциональности на антитела. Хотя антитела ориентации по-прежнему случайных, система преимущества при использовании многих реактивной ПРМ сайты, управляемые по степени полимеризации. Кроме того мы показали, что путем частичной замены ПРМ единиц с амино PEG, гидрофильность поверхности могут быть настроены, дальнейшего повышения эффективности белка восстановления системы18. В целом частиц кремнезема poly(PFPA) привитые были продемонстрированы быть эффективной альтернативой традиционным IP с разумной эффективности, а также много чистых фона.
В этот вклад мы сообщаем альтернативный метод для подготовки poly(PFPA) привитые поверхность для иммобилизации антитела и IP приложения. В простой двухэтапный процесс, как показано на рисунке 1, молекула APTES компоновщика сначала осаждается на поверхности кремния, то poly(PFPA) полимер ковалентно прикрепляется к молекуле компоновщик через реакции между ПРМ единиц на полимерные и Амин функции на APTES. Этот метод подготовки позволяет постоянным сшивки poly(PFPA) к поверхности субстрата, но избегает многих осложнений, связанных с SI-CTA синтеза и SI-плот полимеризации poly(PFPA) кистей. Можно по-прежнему выполняться частичного замещения ПРМ единиц с амино PEG, позволяет тонкой настройки свойств поверхности кисти полимера. Мы покажем, poly(PFPA) привитые кремнезема бусы подготовленный таким образом может быть прикол с антителами и используется для обогащения белка через IP. Процедура подготовки подробных шарик, антитела иммобилизации и IP тестирования документируются в этой статье, для читателей, заинтересованных в поисках альтернативы обычного белка A/G на основе IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Синтез poly(PFPA) привитые SiO2 бусины иллюстрируется на рисунке 1. Используя APTES как компоновщик молекулы, poly(PFPA) щетки ковалентно привитыми к SiO2 субстрата может быть подготовлен через простой двухэтапный процесс. Хотя некоторые подразделения ПРМ приносятся в жер?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана агентство развития (Грант № обороны UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
References
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
