Poli (pentafluorophenyl akrilat) hazırlanması için bir protokol (aşılı poly(PFPA)) silika boncuk sunulur. Poly(PFPA) functionalized yüzey o zaman ile antikorlar immobilize ve başarıyla immunoprecipitation yoluyla protein ayrılması için kullanılır.
Biz poli (pentafluorophenyl akrilat) hazırlamak için basit bir yöntem göstermek (poly(PFPA)) aşılı silis boncuk antikor immobilizasyon ve sonraki immunoprecipitation (IP) uygulama için. Poly(PFPA) aşılı yüzey yolu ile basit bir işlemdir hazırlanır. İlk adımda, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) silis yüzeyine bir bağlayıcı molekül olarak yatırılır. İkinci adımda, poly(PFPA) homopolymer, tersine çevrilebilir toplama ve parçalanma zincir transfer (Sal) polimerizasyonu, yolu ile sentezlenmiş aracılığıyla exchange tepki pentafluorophenyl (Bio) birimler arasında bağlayıcı molekül için üzerine aşılı Polimer ve APTES Amin gruplarında. Devrilmesinden sonra APTES ve poly(PFPA) silika partikülleri x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) tarafından teyit yanı sıra parçacık Boyut değişikliği tarafından izlenen üzerinde dinamik ışık saçılma (DL) ile ölçülür. Boncuklar, kısmi ikame poly(PFPA) Amin functionalized poly(ethylene glycol) ile yüzey hydrophilicity geliştirmek için (amino-PEG) de gerçekleştirilir. PEG yerine poly(PFPA) boncuk sonra ile IP uygulama için antikorlar immobilize silis aşılı. Gösteri, bir antikor protein kinaz RNA-harekete geçirmek (PKR) karşı istihdam ve IP etkinliği Western blot tarafından belirlenir. Çözümleme sonuçlarını immobilize antikor boncuk gerçekten de non-spesifik protein etkileşimleri çok az olmakla birlikte PKR zenginleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir.
Reaktif polimer fırçaları çok ilgi son yıllarda almış. Algılama ve ayırma1,2,3,4gibi alanlarda uygulamaları ile aktif yüzey oluşturmak için organik veya inorganik malzemeler üzerinde fonksiyonel molekülleri hareketsiz için kullanılabilir, 5. Rapor reaktif polimerler arasında pentafluorophenyl ester birimleri içeren aminler ve direnç hidroliz6doğru onların yüksek reaktivite nedeniyle özellikle yararlı olur. Böyle bir polimer poly(PFPA) ve birincil veya İkincil aminler7,8,9,10içeren moleküller ile kolayca functionalized sonrası polimerizasyon olabilir. Bir örnekte, poly(PFPA) fırçalar amino-ışık duyarlı yüzeyler7oluşturmak için spiropyrans ile tepki.
Poly(PFPA) ve uygulamaları hazırlanması, önceki yayınları6,7,8,9,10,11,12 sayısında açıklanan ,13,14,15,16,17. Özellikle, Theato ve iş poly(PFPA) fırçalar “aşılama” hem de “dan aşılama yöntemleri7,8,10,11,12″ ile sentezi bildirdi . “İçin yaklaşım, bir poli (methylsilsesquioxane) aşılama” içinde-poli (pentafluorophenyl akrilat) (poly(MSSQ-PFPA)) Hibrit Polimer sentez8,10,11,12oldu. Poly(MSSQ) bileşeni ile bir dizi farklı organik ve inorganik yüzeyler, böylece kaplanmış malzeme yüzeyinde bir fırça katman oluşturmak poly(PFPA) bileşen izin formu güçlü yapışma başardı. “Üzerinden yaklaşım aşılama”, tersinir ek yüzey başlatılan ve parçalanma zincir transfer (SI-sal) polimerizasyon poly(PFPA) fırçalar7hazırlamak için kullanıldı. Bu durumda, bir yüzey immobilize zinciri Aktarım Aracısı (SI-CTA) ilk kovalent substrat silis-silane reaksiyon ile bağlı. İmmobilize SI-CTA substrat için kararlı kovalent bağ ile yoğun paketlenmiş poly(PFPA) fırçalar üreten PFPA monomerleri, SI-Sal polimerizasyon daha sonra katıldı.
SI-Sal polimerizasyonu sentez poly(PFPA) fırçalar kullanarak, biz son zamanlarda antikorlar aşılı poly(PFPA) silika partikülleri ve protein saflaştırma18sonraki uygulama onların immobilizasyon gösterdi. Poly(PFPA) fırçalar kullanıma antikor immobilizasyon IP üzerinden geçerli protein ayırma ile ilgili konularda bir dizi çözmek için bulundu. Geleneksel IP antikor immobilizasyon19,20,21Protein A/bir bağlayıcı G kullanımına dayanır. Belirli bir yönlendirme ile bağlanmak antikor Protein A/G kullanımı sağlar beri yüksek hedef antijen kurtarma verimliliği elde edilir. Ancak, Protein A/G kullanımı ikisi de arka plan gürültü yüksek bir düzeyde katkıda protein kurtarma sırasında–dan non-spesifik protein etkileşim hem hem antikorlar kaybına uğrar. Bu eksiklikleri gidermek için sağlam bir destek için antikorlar doğrudan polietilenin keşfedilmeyi22,23,24oldu. Bu tür teknikler verimliliğini çapraz antikorlar rasgele yönelimi nedeniyle genellikle düşüktür. Aşılı poly(PFPA) substrat için antikorlar immobilizasyon Satım tepki Bio birimleri ve amin functionalities antikorlar tarih arasında yoluyla elde, kalıcıdır. Antikor yönelimi hala rasgele olsa da, sistem çok reaktif Bio sitelerinde, polimerizasyon derecesine tarafından kontrol edilebilir olan faydaları. Ayrıca, biz gösterdi ki Bio birimleri ile amino-PEG, kısmi ikame tarafından yüzey hydrophilicity, daha fazla sistem18protein kurtarma verimliliğini artırmak ayarlanabilir. Genel olarak, aşılı poly(PFPA) silika partikülleri makul verimliliği hem de çok temiz arka plan ile geleneksel IP etkili bir alternatif gösterilmiştir.
Bu katkı antikor immobilizasyon ve IP uygulama için poly(PFPA) aşılı yüzey hazırlamak için alternatif bir yöntem rapor. Basit bir işlemdir Şekil 1‘ de gösterildiği gibi bir APTES bağlayıcı molekül ilk silis yüzey yatırılır, sonra poly(PFPA) polimer kovalent Bio birimler arasında tepki ile bağlayıcı molekül üzerinde bağlı olduğu Polimer ve APTES Amin işlevleri. Bu hazırlama yöntemi poly(PFPA) bir substrat yüzeye kalıcı polietilenin izin veren ancak SI-CTA sentezi ve SI-Sal polimerizasyon poly(PFPA) fırça ile ilgili birçok komplikasyonları önler. Amino-PEG Bio birimleriyle kısmi ikame hala, polimer fırça yüzey özelliklerini ince ayar sağlayan gerçekleştirilebilir. Biz böylece hazırlanan aşılı poly(PFPA) silika boncuk ile antikorlar immobilize ve protein zenginleştirme IP üzerinden için kullanılan gösterir. Detaylı boncuk hazırlık prosedürü, antikor immobilizasyon ve IP test bu makalede belgelenen, okuyucular arayışında baktılar için geleneksel Protein A/G alternatif IP tabanlı.
Poly(PFPA) sentezi SiO2 boncuk Şekil 1‘ de gösterildiği aşılı. APTES bir bağlayıcı molekül istihdam ederek, kovalent SiO2 substrat için aşılı poly(PFPA) fırçalar basit bir işlemdir yolu ile hazırlanabilir. Her ne kadar bazı Bio birimlerinin APTES ile reaksiyonu için feda, Bio birimleri çok sayıda amino-PEG veya antikorlar ile daha sonra tepki için kullanılabilir kalması beklenir. Bio grupları poly(PFPA) fırçalar değil solvate su<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser için savunma geliştirme (Grant No ajansı tarafından desteklenmiştir UD170039ID).
2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
KCl | Invitrogen | AM9640G | |
NP-40 | VWR | E109-50ML | |
Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |