Préparation de Poly(pentafluorophenyl acrylate) fonctionnalisés SiO2 perles pour la Purification de protéines
Summary
Un protocole pour la préparation de poly (acrylate de pentafluorophényl) (perles de silice greffée de poly(PFPA)) est présentée. La surface fonctionnalisés poly(PFPA) est ensuite immobilisée avec des anticorps et utilisée avec succès pour la séparation de la protéine par immunoprécipitation.
Abstract
Nous démontrons une méthode simple pour préparer les poly (acrylate de pentafluorophényl) (poly(PFPA)) greffés perles de silice pour immobilisation des anticorps et l’application ultérieure immunoprécipitation (IP). La surface greffées poly(PFPA) est préparée par un processus en deux étapes simples. Dans un premier temps, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) se dépose comme une molécule de l’éditeur de liens sur la surface de la silice. Dans la deuxième étape, poly(PFPA) homopolymère, synthétisé par l’addition réversible et polymérisation de transfert (RAFT) chaîne fragmentation, est greffée à la molécule de l’éditeur de liens par l’intermédiaire de la réaction d’échange entre les unités de pentafluorométhyl (PPP) sur le polymère et les groupes amine sur APTES. Les dépôts de APTES et poly(PFPA) sur la silice particules sont confirmées par spectrométrie de photoélectrons (XPS), ainsi que surveillés par le changement de taille de particules mesurées via la diffusion de la lumière dynamique (DLS). Pour améliorer la surface hydrophilicité des perles, substitution partielle de poly(PFPA) avec poly(ethylene glycol) amine fonctionnalisés (amino-PEG) est également réalisée. Le poly(PFPA) PEG-substitués greffés silice perles sont alors immobilisés avec des anticorps pour l’application de la propriété intellectuelle. Pour démonstration, un anticorps dirigé contre la protéine kinase activée par RNA (PKR) est employé, et efficacité de la propriété intellectuelle est déterminée par Western Blot. Les résultats d’analyse montrent que les perles d’anticorps immobilisé en effet peuvent servir à enrichir PKR, tandis que les interactions entre protéines non spécifiques sont minimes.
Introduction
Brosses de polymère réactif ont reçu beaucoup d’intérêt ces dernières années. Ils peuvent être utilisés pour immobiliser des molécules fonctionnelles sur les matières organiques ou inorganiques pour créer des surfaces activées avec des applications dans des domaines tels que la détection et la séparation1,2,3,4, 5. Parmi les polymères réactives signalés, ceux contenant des unités pentafluorophényl ester sont particulièrement utiles en raison de leur forte réactivité avec des amines et résistance envers l’hydrolyse6. Une tel polymère est poly(PFPA), et il peut être facilement fonctionnalisée après polymérisation avec des molécules contenant des amines primaires ou secondaires7,8,9,10. À titre d’exemple, poly(PFPA) brosses ont réagi avec amino-étude pour créer des surfaces sensibles à la lumière de7.
La préparation de poly(PFPA) et ses applications ont été décrites dans un certain nombre de précédents publications6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. En particulier, Theato et ses collaborateurs a signalé la synthèse de poly(PFPA) brosses « greffage à » et « greffage de » méthodes7,8,10,11,12 par . Dans le « greffage de » approche, un poly (methylsilsesquioxane)-poly (acrylate de pentafluorophényl) (polymère hybride poly(MSSQ-PFPA)) a été synthétisé8,10,11,12. Le composant poly(MSSQ) réussit à adhérence forte forme avec un certain nombre de différentes surfaces organiques et inorganiques, permettant ainsi le composant poly(PFPA) former une couche de pinceau sur la surface du matériau enduite. Dans le « greffage de » approche, surface amorcée addition réversible et polymérisation par transfert (SI-RAFT) chaîne fragmentation a été utilisée pour préparer poly(PFPA) brosses7. Dans ce cas, un agent de transfert de chaîne immobilisée surface (SI-LTC) a été tout d’abord de façon covalente au substrat par réaction de la silice-silane. Le SI-Dec immobilisé participe ensuite à la polymérisation de SI-radeau de monomères PFPA, générant des brosses poly(PFPA) dense avec stable liaison covalente au substrat.
En utilisant les brosses poly(PFPA) synthétisés par polymérisation de SI-radeau, nous avons récemment démontré l’immobilisation des anticorps sur les particules de silice greffée de poly(PFPA) et leur application ultérieure dans la purification de protéines18. L’utilisation de brosses poly(PFPA) pour l’immobilisation de l’anticorps a été trouvée pour résoudre un certain nombre de questions liées à l’actuelle séparation de protéines par IP. IP classique repose sur l’utilisation de la protéine A/G comme un linker pour anticorps immobilisation19,20,21. Étant donné que l’utilisation de la protéine A/G permet les anticorps être attaché avec une orientation spécifique, efficacité de récupération de l’antigène cible élevé est atteint. Cependant, l’utilisation de la protéine A/G souffre d’interaction des protéines non spécifiques comme la perte d’anticorps lors de la récupération de protéines, qui contribuent à un niveau élevé de bruit de fond. Pour combler ces lacunes, réticulation directe des anticorps sur un support solide a été exploré22,23,24. L’efficacité de ces techniques est généralement faible en raison de l’orientation aléatoire des anticorps réticulé. Pour le substrat poly(PFPA) greffés, l’immobilisation des anticorps est permanente, obtenue par la réaction d’échange entre les unités de la PFP et fonctionnalités amine sur les anticorps. Bien que l’orientation de l’anticorps est toujours aléatoire, le système bénéficie d’avoir plusieurs sites réactifs de PPP, contrôlables par le degré de polymérisation. En outre, nous avons montré qu’en substitution partielle des unités ppp avec amino-PEG, hydrophilicité de surface peut être ajustée, améliorer davantage l’efficacité de récupération de protéines du système18. Dans l’ensemble, les particules de silice greffée de poly(PFPA) se sont avérés être une alternative efficace à la propriété intellectuelle traditionnelle avec une efficacité raisonnable, mais aussi beaucoup plus propre arrière-plan.
Dans cette contribution, nous présentons une méthode alternative pour préparer des poly(PFPA) surface greffées pour immobilisation des anticorps et l’application de la propriété intellectuelle. Dans un processus simple en deux étapes, comme illustré dans la Figure 1, une molécule de linker selon est tout d’abord déposée sur la surface de la silice, puis le polymère poly(PFPA) est covalente de la molécule de l’éditeur de liens par l’intermédiaire de la réaction entre les unités de PPP sur la polymère et les fonctions amines sur APTES. Cette méthode de préparation permet la réticulation permanente des poly(PFPA) sur une surface de substrat, mais évite les nombreuses complications associées de synthèse SI-LTC et polymérisation TR-radeau de brosses poly(PFPA). Une substitution partielle des unités ppp avec amino-PEG peut encore être effectuée, permettant un réglage fin des propriétés surface polymère brosse. Nous montrons les billes de silice poly(PFPA) greffés ainsi préparés peuvent être immobilisés avec des anticorps et utilisés pour l’enrichissement en protéines via IP. La procédure de préparation détaillées perle, immobilisation des anticorps et le test IP sont documentés dans cet article, pour les lecteurs intéressés par la recherche d’une alternative aux classique protéine A/G basés IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La synthèse de poly(PFPA) greffés SiO2 perles est illustrée à la Figure 1. En employant selon comme une molécule de l’éditeur de liens, brosses poly(PFPA) greffés par covalence à SiO2 substrat peuvent être préparés grâce à un processus en deux étapes simples. Même si certaines unités PPP sont sacrifiés pour la réaction avec APTES, un grand nombre des unités de PPP est censé rester disponible pour une réaction plus tard avec amino-PEG ou anticorps….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Agence pour le développement de défense (Grant No. UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
References
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