Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler
Summary
Denne artikel illustrerer en kraftfuld metode til at anslå mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinationen af lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer med fluorescently konjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører giver mulighed for kvantificering af disse organeller i blandet cellepopulationer, som primær celler høstet fra vævsprøver, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri.
Abstract
T-celler udnytte forskellige metaboliske programmer til at matche deres funktionelle behov under differentiering og spredning. Mitokondrier er afgørende cellulære komponenter, der er ansvarlige for at levere celle energi; dog producere overskydende mitokondrier også reaktive ilt arter (ROS), som kunne forårsage celledød. Antallet af mitokondrier skal derfor hele tiden justeres for at passe behov af celler. Denne dynamiske forordning opnås delvis gennem funktionen af lysosomer at fjerner overskud/beskadiget organeller og makromolekyler. Derfor, cellulære mitokondrie og lysosomale indhold er vigtige indikatorer til at vurdere den metaboliske justering af celler. Med udviklingen af sonder til organeller, er godt karakteriseret lysosomet eller mitokondrier-specifikke farvestoffer blevet tilgængelige i forskellige formater til at mærke cellulære lysosomer og mitokondrier. Flerfarvet flowcytometri er et fælles redskab til profil celle fænotyper, og har kapacitet til at blive integreret med andre assays. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol af hvordan man kan kombinere organelle-specifikke farvestoffer med celleoverflademarkører farvning for at måle mængden af lysosomer og mitokondrier i forskellige T-cellepopulationer på en flow Flowcytometret.
Introduction
Aktivering og spredning af T-celler er kritiske trin til montering vellykket immunrespons. De seneste fremskridt tyder på, at den cellulære metabolisme er tæt forbundet med både udvikling og funktioner af T-celler. For eksempel, stole naive T celler i vid udstrækning på oxidativ fosforylering (OXPHOS) til at opfylde efterspørgslen efter energi under recirkulation blandt sekundære lymfoide organer. Ved aktivering undergår naive T celler drastiske metaboliske omprogrammering, inklusive induktion af aerobe glykolyse at øge ATP produktionen og opfylde de enorme metaboliske krav under Celledifferentiering og spredning. De celler, der undlader at følge gennem metaboliske behov dør af apoptose1,2. Under den metaboliske omprogrammering, spiller mitokondrier en vigtig rolle siden de er de hovedansvarlige for produktionen af ATP til at levere energi til cellens organeller, og cellulære mitokondrier indhold svinger under metaboliske switche hele T-celle udvikling og aktivering3. Men ophobning af overflødige eller beskadigede mitokondrier kan producere overskydende ROS, der skader lipider, proteiner og DNA, og kan i sidste ende føre til celle død4
Overdreven eller beskadigede mitokondrier skyldes stofskifteforandringer er fjernet af en specialiseret form for autophagy5, kendt som mitophagy. Mitokondrier er pakket med autophagosomes og derefter sammensmeltet med lysosomer for nedbrydning. Disse tæt kommunikation mellem mitokondrier og lysosomer har skabt stor interesse6,7. For eksempel, oxidativ stress stimulerer mitokondrier at danne mitokondrier-afledte vesikler (MDVs), der er målrettet til lysosomer for nedbrydning i en fosfatase og tensin homolog (PT)-induceret formodede kinase 1 (PINK1) og parkin (en E3 ubiquitin ligase) afhængige måde8. Det konstateredes også, at mitophagy er afgørende for beige til hvid adipocyt overgang9,10. Endnu vigtigere, er lysosomer ikke blot en nedbrydning rum, men også en regulator af cellulær signalering. Overdreven substrat ophobning på grund af enzymet mangler resulterer i lysosomale dysfunktion ved at forstyrre lysosomale membran permeabilitet og påvirker Ca2 + homøostase11. T-celle funktionelle defekter i lysosomale syre lipase (LAL)12 eller lysosomale metabolit transporter knockout mus model13 viste yderligere betydningen af lysosomer for opretholdelsen af T celle homøostase. Både mitokondrier og lysosomer er uadskillelige dele af cellulære metaboliske forordning. Derfor, måling af cellulære mitokondrie indhold har været en afgørende indikator til at evaluere T-celle metaboliske og funktionelle status.
Assays almindeligvis anvendes til at kvantificere cellulære mitokondrie eller lysosomale indholdet omfatter immunblot, elektronmikroskopi, immunfluorescent (IF) farvning og PCR analyse af mitokondriel DNA kopi numre14,15, 16. mens immunblot kan kvantitativt sammenligner protein niveauer på tværs af forskellige prøver og elektron eller hvis mikroskopi kan visualisere morfologiske kendetegnende for disse organeller17, disse assays bærer visse tekniske ulemper. For eksempel, er det tidskrævende at erhverve tilstrækkeligt antal celle billeder med høj forstørrelse og opløsning eller til at sammenligne udtryk niveauet af et protein på tværs af snesevis af prøver, hvilket gør disse assays, anses for at være lav dataoverførselshastighed metoder. Desuden kan disse assays kun anvendes til homogen celle population, såsom cellelinjer, men ikke til vævsprøver, der består af blandede befolkninger.
Det er også vanskeligt at anvende disse assays til sjældne populationer, som krav om minimal celle numre fra 106 108 er umuligt at opfylde. Endelig er celler normalt mængden eller fast under processen, hvilket gør dem uforenelige med andre metoder til at ekstrahere yderligere oplysninger. Sammenlignet med de traditionelle metoder, fluorescerende-baserede flowcytometri har en relativt høj overførselshastighed – oplysninger for alle celler i en stikprøve bestående af blandet cellepopulationer kan analyseres og indsamlet samtidig. Derudover kan registrere mere end 10 parametre på den samme celle og sortere cellerne baseret på ønskede fænotyper for yderligere assays. Reaktiv fluorescerende sonder har været brugt til at mærke lysosomer og mitokondrier i levende celler og kan påvises ved flow flowcytometri18,19. Disse organelle-specifikke sonder har celle gennemtrængelige og fysisk-kemiske egenskaber, som tillader dem at være koncentreret i bestemte subcellulært steder eller organeller. Bekvemt, disse sonder er tilgængelige i forskellige fluorescerende formater, således at deres ansøgning om multicolor analyse.
Denne protokol beskriver i detaljer hvordan man kan kombinere overflade markør farvning med lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer til etiketten lysosomer eller mitokondrier i levende celler. Dette er især nyttigt for prøver genereret fra primære væv og organer, der ofte består af heterogene cellepopulationer. Forskere kan identificere cellepopulationer af interesse ved deres overflade markør udtryk og specielt måle lysosomale eller mitokondrie indholdet gennem organelle-specifikke farvestoffer i disse celler. Her viser vi en detaljeret procedure for flow cytometric analyse, der evaluerer den lysosomale eller mitokondrie masse i de store milt T celle delpopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol kombinerer organelle-specifikke farvestoffer og overflade markør farvning for at kvantificere mængden af mitokondrier eller lysosomer i forskellige T-cellepopulationer. Denne metode blev udviklet for at overvinde begrænsningen af celle nummer og homogenitet krav til traditionelle metoder, såsom elektronmikroskopi og immunblot analyse. Det er især nyttigt i at analysere sjældne cellepopulationer og samtidig undersøge flere celletyper på samme tid.
Procedurens varighed og …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udviklingen af denne protokol blev støttet af tilskud fra Taiwan Ministeriet for videnskab og teknologi (mest) NSC103-2320-B-010-002-MY2 og MOST104-2628-B-010-002-MY4 til CL Hsu. C.W. Wei er en modtager af fremragende afhandling Award af Institut for Mikrobiologi og Immunologi, National Yang-Ming University.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
References
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
