Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje
Summary
Dit protocol zowel visueel communiceert de hersenstam-ruggenmerg voorbereiding en de voorbereiding van de hersenstam dwarse segmenten verduidelijkt in een uitgebreide stapsgewijze manier. Het werd ontworpen om de reproduceerbaarheid verhogen en de kans voor het verkrijgen van levensvatbare, langdurig, ritmisch-actieve segmenten voor het opnemen van neurale uitvoer uit de luchtwegen gebieden van de hersenstam te verbeteren.
Abstract
Zoogdieren inspiratory ritme is gegenereerd vanuit een neuronale netwerk in een regio van de medulla genoemd de preBötzinger complexe (pBC), die produceert een signaal rijden de ritmische samentrekking van inspiratory spieren. Ritmische neurale activiteit gegenereerd in de pBC en droeg naar andere neuronale zwembaden om te rijden die de musculatuur van de ademhaling kan worden bestudeerd met behulp van verschillende benaderingen, waaronder en bloc zenuw opnames en transversale segment opnames. Echter, eerder gepubliceerde methoden hebben niet uitvoerig beschreven de hersenstam-ruggenmerg dissectie proces op een transparante en reproduceerbare wijze voor toekomstige studies. Hier presenteren we een uitgebreid overzicht van een methode die wordt gebruikt om reproducibly ritmisch-actieve hersenstam segmenten met de noodzakelijke en voldoende neuronale circuits voor het genereren en verzenden inspiratory station. Dit werk bouwt voort op eerdere hersenstam-ruggenmerg electrofysiologie protocollen ter verbetering van de kans op een betrouwbare manier verkrijgen van levensvatbare en ritmisch-actieve segmenten voor het opnemen van neuronale output van de pBC, hypoglossal premotor neuronen (XII pMN), en hypoglossal motorische neuronen (XII MN). Het werk gepresenteerd breidt op eerdere gepubliceerde methoden door het verstrekken van gedetailleerde, stapsgewijze illustraties van de dissectie, van hele rat pup, naar in-vitro segment met de XII worteltjes.
Introduction
Het respiratoire neurale netwerk van de hersenstam biedt een vruchtbare domein voor het begrijpen van de algemene kenmerken van ritmische neurale netwerken. Met name is het belang bij de ontwikkeling van neonatale knaagdier ademhaling en begrijpen hoe het ritme van de ademhaling ontwikkelt. Dit kan worden gedaan met behulp van een multi-level aanpak, met inbegrip van in vivo hele dierlijke plethysmography, in vitro en bloc zenuw opnames, en in vitro slice opnames die de ademhaling ritme generator bevatten. Reductionistische in vitro nl blok en segment-opnamen zijn een voordelige methode moet worden gebruikt bij het ondervragen van de mechanismen achter respiratoire rhythmogenesis en neurale circuits in de hersenstam-ruggenmerg regio knaagdieren te ontwikkelen. De ontwikkelende ademhalingswegen omvat ongeveer 40 soorten cellen, gekenmerkt door middel van verhitting patroon, met inbegrip van die van de centrale respiratoire1,2. Het centrale respiratoire netwerk omvat een groep van ritmisch actieve neuronen gelegen in de rostraal ventrolateral medulla1,3. Zoogdieren respiratoire rhythmogenesis wordt gegenereerd uit een autorhythmic interneuron netwerk genaamd de complexe preBötzinger (pBC), die is gelokaliseerd experimenteel via zowel nl als segment blok preparaten van neonatale zoogdier hersenstam-spinal glaskoord3,4,5,6,7,8. Deze regio serveert een vergelijkbare functie naar het sinoatrial knooppunt (SA) in het hart en genereert een inspiratory timing systeem station ademhaling. Van de pBC gebeurt het inspiratory ritme aan andere gebieden van de hersenstam (met inbegrip van de hypoglossal motor kern) en spinale motor zwembaden (zoals de phrenic motorische neuronen die het middenrif rijden)9.
Ritmische activiteit kan worden verkregen met behulp van de hersenstam ruggenmerg nl blok preparaten of segmenten uit een verscheidenheid van cel bevolking, met inbegrip van C3-C5 zenuw worteltjes, XII zenuw worteltjes, hypoglossal motor nucleus (XII MN), hypoglossal premotor neuronen (XII pMN), en de pBC3,10,11,12. Terwijl deze methoden voor het verzamelen van gegevens over een handvol laboratoria succesvol zijn geweest, zijn veel van de protocollen niet gepresenteerd op een manier die volledig kunnen worden gereproduceerd voor nieuwe onderzoekers in het veld invoeren. Verkrijgen van levensvatbare en ritmisch actieve nl blok en segment voorbereidingen vereist een acute aandacht voor detail door alle stappen van de dissectie en segment snijden protocol. Eerdere protocollen uitgebreid beschrijven de verschillende opname procedures en electrofysiologie, maar gebrek aan detail in het meest kritische deel van het verkrijgen van een levensvatbare weefsel voorbereiding: uitvoeren van de hersenstam-ruggenmerg dissectie en segment procedure.
Efficiënt hersenstam-ruggenmerg electrofysiologie opnamen verkrijgen een ritmisch-actieve en levensvatbare nl blok of segment voorbereiding vereist dat alle stappen correct, zorgvuldig en snel worden uitgevoerd (meestal de hele procedure gerelateerde hier kan uitgevoerd in ongeveer 30 min). Kritische punten van de hersenstam-ruggenmerg electrofysiologie protocol die niet zijn eerder goed beschreven zijn onder meer de dissectie van zenuw worteltjes en de segmenteringshulplijnen procedure op de vibratome. Dit protocol is de eerste stapsgewijze communiceren visueel de dissectie van de hersenstam-ruggenmerg voor zowel nieuwe onderzoekers en deskundigen op dit gebied. Dit protocol wordt ook grondig uitgelegd chirurgische technieken, monumenten en andere procedures bij toekomstige onderzoekers segmenten en de en bloc preparaten bevatten de exacte circuits gewenst in elk experiment standaardiseren. De procedures die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt in zowel rat en muis neonatale pups.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aanpassing van het protocol hier gepresenteerd in een blok nl of segment werkstroom is gunstig voor laboratoria en studies die wil gebruik maken van beide en bloc hersenstam-ruggenmerg en/of dun schijfje preparaten voor electrofysiologie opnamen. De dissectie en segment methode gepresenteerd, gecombineerd met de methoden die eerder door anderen gemeld17,18,19, reproduceerbare voorbereiding van robuust en levensvatbare weefsel da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P is een ontvanger van een Loma Linda University zomer Undergraduate Research Fellowship.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
