Vi præsenterer her, en protokol, der beskriver allogene hæmatopoietisk stamcelletransplantation og tillader gentagne mini-endoskopisk evalueringer af den distale colon på levestedet for tilstedeværelse, egenskaber og sværhedsgraden af Colon betændelse i live mus lider af intestinal graft – versus – host sygdom.
Akut graft – versus – host-sygdommen (GvHD) repræsenterer den mest alvorlige komplikation at patienter tidligere i allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation (allo-HCT) ansigt og er ofte forbundet med en dårlig klinisk resultat. Stykke tid, for eksempel GvHD manifestationer af huden er normalt lydhør over for etablerede immun-undertrykkende behandlingsformer og, derfor, tage ikke en fatal kurs, tilstedeværelse og intensiteten af intestinal GvHD, især af de mid-til-nedre dele af tarmen, påvirke stærkt resultatet og samlet overlevelse af patienter med akut GvHD. terapeutiske muligheder er hovedsagelig begrænset til de klassiske immun-undertrykkende agenter giver kun moderat sygdom-formildende effekter. Derfor, detaljeret viden om væv-resident immun kaskade, ændringer i den tarmens mikrobiota, og stromale svaret før, på og efter tarm GvHD indsættende det er tvingende nødvendigt at forstå de begivenheder og underliggende mekanismer sin patogenese og udvikle nyskabende terapeutiske muligheder. Murine modeller af GvHD er ofte ansat til at identificere og funktionelt vurdere molekyler og veje derfor køre intestinal GvHD. Dog mangler midler til specielt at overvåge og evaluere tarmbetændelse over tid væsentlige da etablerede noder til at vurdere og grade akut GvHD rutinemæssigt består af forskellige parametre, som snarere afspejler systemisk GvHD manifestationer. Den detaljerede evaluering af intestinal GvHD er blevet begrænset til undersøgelser ved hjælp af aflivede mus, derved hovedsagelig undtagen længderetningen (dvs., kinetic) analyser af Colon rum under en given eksperimentelle tilstand (fx antistof-medieret blokade af en proinflammatoriske cytokin) i levende mus (dvs., i vivo). Mini-endoskopisk in situ vurderingen af den distale colon af allo-HCT-behandlede mus beskrevet her tillader en) en detaljeret makroskopisk evaluering af forskellige aspekter af tarmbetændelse og b) mulighed for at indsamle vævsprøver for downstream analyser på forskellige tidspunkter i løbet af observationsperioden. Generelt, den mini-endoskopiske tilgang giver et stort fremskridt i prækliniske noninvasive overvågning og vurdering af intestinal GvHD.
Hæmatopoietisk maligniteter som hidrører direkte fra hæmatopoietisk stamcelle rum og ukontrolleret, er hurtigt forløber, og svær immun-medierede sygdomme ofte tegn på at udføre allo-HCT1,2. Selv om regnskab for forekomst af prognostiske gavnlige graft-versus-tumor respons, er donor lymfocytter dog ofte overtalelse og fremme en uønsket immun-medieret angreb af sunde væv komponenter i allo-HCT modtageren , en proces, der kaldes graft – versus – host-sygdommen3. Manifestationer i tarmen, den såkaldte intestinal GvHD, repræsenterer den mest frygtede komplikation til akut GvHD, alvorlige former som er rutinemæssigt forbundet med en høj dødelighed1,2,4.
Samlede, murine modeller af allo-HCT er dukket op som uvurderlige værktøjer til at identificere og undersøge immun-medierede mekanismer patogenesen af GvHD5. Dog kinetic vurdering af, for eksempel, gavnlige virkninger af nye terapeutiske interventioner over tid i levende mus er rutinemæssigt baseret på bestemmelse af kliniske GvHD scorer6. Mens disse scores er egnet til at afspejle, for eksempel, den samlede sygdom byrde (dvs. den systemiske GvHD), kliniske scorer manglende følsomhed for at pålideligt spejle orgel-specifikke manifestationer (f.eks., i tarmen). Derfor, konklusioner, for eksempel med hensyn til gut-beskyttende virkninger af en given terapeutisk intervention, der er baseret på disse scoring systemer normalt kommer til kort.
Trods store fremskridt gennem opfindelsen af romanen hele kroppen imaging modaliteter i kombination med brug af enten en bioluminescerende eller fluorescerende genetiske mus modeller7,8, metoder til direkte og specifikt vurdere den intestinale manifestation af GvHD i levende mus mangler. Rationalet bag protokollen af endoskopisk vurderingen af intestinal GvHD fænotype beskrevet i næste afsnit er derfor, at overvinde denne hindring. Motivationen er derudover også at reducere eksperimentelle mus tal siden hidtil, en detaljeret vurdering af de cellulære, morfologiske og molekylære karakteristika (f.eks., ved histopatologi eller Molekylærbiologi) af intestinal GvHD manifestation har i sidste ende kræves ofringen af eksperimentelle musen.
Vores institution har tidligere rapporteret på metode for en mini-endoskopisk vurdering af Colon manifestationer i løbet af syngeneic colitis modeller9. I protokollen præsenteres her, har vi forfinet og tilpasset den colonoscopic scoring matrix for alloresponse-drevet colitis i levende mus med tarm GvHD ved transplantation af alloreactive HCT og donor lymfocytter i en MHC klasse jeg helt forkert indstilling . Vi identificerede fire parametre egnet til at afspejle intestinal GvHD-relaterede Colon læsioner. Desuden, vi etableret et system, der tillader en finjusteret sortering af en enkelt faktor, hvilket resulterer i en ny score, der let informerer læseren om sværhedsgraden af intestinal GvHD stede i en given musen på et givet tidspunkt. Histopatologisk analyser bekræftet, at en endoskopisk score over en vis tærskel er pålideligt at forudsige moderat til høj grade væv betændelse. Derfor, mini-endoskopisk evaluering synes at repræsentere en arbejdende erstatning for den guld standard histopatologisk undersøgelse, der rutinemæssigt kræver ofringen af de eksperimentelle mus. Vigtigst, denne protokol kan anvendes til næsten enhver given tid og kan bruges flere gange i løbet af sygdommen10,11. Desuden, i modsætning til brugen af bioluminescens-afhængige tilgange, ingen labor-intens og tidskrævende foranstaltninger som intercrossing genetisk modificerede mus er påkrævet, og dermed metoden kan anvendes på stort set alle mus linje af interesse.
Taget under ét, givet den skadelige klinisk perspektiv af allo-HCT patienter med svær intestinal GvHD, er hurtige videnskabelige fremskridt og større indsigt i de molekylære mekanismer bag immun patogenesen tvingende nødvendigt. Vigtigt, etiske overvejelser kræver ligeledes, at gevinst på viden bør opnås med brugen af det minimale antal eksperimentelle mus. Derfor anerkendte både fordringer på Fællesskabets forskning at udforske intestinal GvHD kan være avanceret ved at gennemføre serie mini-endoskopisk evalueringer af tyktarmen i eksperimentelle arbejde kæden til at overvåge og grade intestinal GvHD i live eksperimentelle mus modeller, som beskrevet og valideret i protokollen præsenteres her.
Protokollen beskriver metode til induktion og mini-endoskopisk vurdering af Colon fænotype observeret i løbet af intestinal GvHD. Det tjener det større formål af gør det muligt for forskere at studere intestinal GvHD på langs og noninvasively over det hele sygdomsforløb (dvs. fra starten af Colon manifestation og progression indtil maksimal sygdomsaktivitet).
Der er imidlertid nogle kritiske trin og vigtige begrænsninger iboende at de præsenterede metoder eksperimentatoren skal være …
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af den kollaborative forskning Centre (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projekt B03) (til K.H.) og CRC 1181 (CRC-DFG, projekt B05) (til K.H.), begge finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation).
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |