Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen
Summary
Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft – versus – host-ziekte lijden.
Abstract
Acute graft – versus – host-ziekte (GVGH) vertegenwoordigt de meest ernstige complicatie dat patiënten eerder ondergaan Allogene hematopoietische stamcel transplantatie (allo-HCT) gezicht en wordt vaak geassocieerd met een slechte klinische uitkomst. Terwijl, bijvoorbeeld, GVGH uitingen van de huid zijn meestal inspelen op gevestigde immuun-onderdrukkende therapieën en, vandaar, niet nemen een fatale cursus, de aanwezigheid en de intensiteit van intestinale GVGH, vooral van de medio-aan-onderste delen van de darm, sterk beïnvloeden het resultaat en algehele overleving van patiënten met acute GVGH. therapeutische opties zijn in wezen beperkt tot de klassieke immuun-onderdrukkende agenten slechts matig ziekte-beperkende effecten oplevert. Vandaar, gedetailleerde kennis over de weefsel-ingezeten immuun cascade, veranderingen in de intestinale microbiota, en het voorafgaande, op en na intestinale GVGH begin stromale antwoord dringend nodig zijn om te begrijpen van de gebeurtenissen en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese en het ontwikkelen van innovatieve therapeutische opties. Lymfkliertest modellen van GVGH zijn vaak aangewend om te kunnen bepalen en beoordelen functioneel moleculen en trajecten vermeende rijden intestinale GVGH. Echter, kunnen specifiek monitoren en evalueren van intestinale ontsteking na verloop van tijd in wezen ontbreken aangezien gevestigde scores te beoordelen en rang van acute GVGH routinematig bestaan uit verschillende parameters die eerder systemische GVGH weerspiegelen manifestaties. De gedetailleerde evaluatie van intestinale GVGH is beperkt met behulp van euthanized muizen, waardoor in wezen exclusief longitudinale studies (dat wil zeggen, kinetische) analyses van het Colon compartiment onder een bepaalde experimentele voorwaarde (bijvoorbeeld antilichaam-gemedieerde blokkade van een cytokine proinflammatoire) in levende muizen (dat wil zeggen, in vivo). De mini-Endoscopische in situ evaluatie van de distale dikke darm van allo-HCT-testgroep muizen hier beschreven staat a) een gedetailleerde macroscopische evaluatie van verschillende aspecten van darmontstekingen en b) de mogelijkheid om het verzamelen van weefselmonsters voor downstream analyses op verschillende tijdstippen in de loop van de waarnemingsperiode. De mini-Endoscopische benadering biedt over het algemeen een grote stap vooruit in de preklinische noninvasive monitoring en evaluatie van intestinale GVGH.
Introduction
Hematopoietische maligniteiten die rechtstreeks voortvloeien uit het compartiment hematopoietische stamcellen en ongecontroleerde, zijn snel vordert, en ernstige immuun-gemedieerde aandoeningen vaak aanwijzingen voor het uitvoeren van allo-HCT1,2. Hoewel boekhouding voor het vóórkomen van de prognostische gunstig graft-versus-tumor reactie, zijn donor lymfocyten echter vaak inducerende en bevordering van een ongewenste immuun-gemedieerde aanval van gezond weefsel componenten binnen de allo-HCT-ontvanger , een proces dat graft – versus – host-ziekte3 heet. Uitingen in de darm, de zogenaamde intestinale GVGH, vertegenwoordigen de meest gevreesde complicatie van acute GVGH, ernstige vormen van die routinematig geassocieerd met een hoge mortaliteit1,2,4 worden.
Algemene, lymfkliertest modellen van allo-HCT opgedoken als waardevolle instrumenten te identificeren en immuun-gemedieerde mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van GVGH5te bestuderen. Echter, kinetische beoordeling van, bijvoorbeeld, gunstige effecten van nieuwe therapeutische ingrepen na verloop van tijd in levende muizen routinematig berust op de vaststelling van klinische GVGH scoort6. Terwijl deze scores geschikt om na te denken zijn, bijvoorbeeld, de totale ziektelast (dat wil zeggen, de systemische GVGH), klinische scoort ontbreken de gevoeligheid betrouwbaar gespiegeld orgel-specifieke manifestaties (b.v., in de darm). Vandaar, conclusies, bijvoorbeeld met betrekking tot de gut-beschermende effecten van een bepaalde therapeutische interventie, die zijn gebaseerd op deze systemen meestal scoren tekortkomen.
Ondanks de grote vooruitgang door de uitvinding van nieuwe gehele lichaam imaging modaliteiten in combinatie met het gebruik van beide bioluminescente of TL genetische muis modellen7,8, methodologieën om rechtstreeks en specifiek beoordelen de intestinale manifestatie van GVGH in levende muizen ontbreken. Vandaar, de grondgedachte achter het protocol van de Endoscopische beoordelingvan de intestinale GVGH fenotype beschreven in de volgende sectie is het overwinnen van deze hindernis. Bovendien, de motivatie ook is om experimentele muizen nummers sinds, tot nu toe een gedetailleerde evaluatie van de moleculaire, cellulaire en morfologische kenmerken (bijvoorbeeld, door histopathologie of moleculaire biologie) voor intestinale GVGH manifestatie heeft uiteindelijk het offer van de experimentele muis nodig.
Onze instelling heeft eerder gerapporteerd over de methodologie van een mini-Endoscopische beoordeling van Colon manifestaties in de loop van syngeneic ulcerosa modellen9. In het protocol hier gepresenteerd, hebben we verfijnd en aangepast de colonoscopic matrix scoren voor alloresponse-gedreven colitis in levende muizen met intestinale GVGH na transplantatie van alloreactive HCT en donor lymfocyten in een MHC klasse ik volledig verkeerde instelling . We geïdentificeerd vier parameters geschikt om na te denken van intestinale GVGH-gerelateerde Colon laesies. Bovendien vastgesteld we een systeem dat toelaat een verfijnd sortering van enkele determinant, resulterend in een nieuwe stand die gemakkelijk de lezer over de ernst van intestinale GVGH aanwezig in een bepaalde muis op een bepaald tijdstip informeert. Histopathologische analyses bevestigd dat een Endoscopische score boven een bepaalde drempel is betrouwbaar het voorspellen van matige tot hoge rang weefsel ontsteking. Vandaar, mini-Endoscopische evaluatie lijkt te vertegenwoordigen invaller werken voor de goudstandaard histopathologisch onderzoek waarvoor routinematig het offer van de experimentele muizen. Bovenal dit protocol kan worden toegepast op vrijwel elk punt gegeven moment en kan herhaaldelijk worden gebruikt in de loop van de ziekte10,11. Bovendien, in tegenstelling tot het gebruik van bioluminescentie-afhankelijke benaderingen, geen arbeid-intensieve en tijdrovende maatregelen zoals intercrossing genetisch muizen gemodificeerde zijn vereist en, vandaar, de methodologie kan worden toegepast op vrijwel elke regel van de muis van de belang.
Tezamen, gegeven het schadelijk klinische perspectief van allo-HCT patiënten met ernstige intestinale GVGH, zijn snelle wetenschappelijke vooruitgang en meer inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de immuun pathogenese dringend noodzakelijk. Evenzo eisen belangrijk, ethische overwegingen dat de winst van kennis moet worden bereikt met het gebruik van het minimale aantal experimentele muizen. Vandaar, zowel erkende vorderingen op de onderzoekgemeenschap verkennen van intestinale GVGH kunnen worden gevorderd door de uitvoering van seriële mini-Endoscopische evaluaties van de dikke darm in de experimenteel werk-keten te controleren en rang van intestinale GVGH in levende experimentele muis modellen, als beschreven en gevalideerde in het protocol hier gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschrijft de methodologie van inductie en mini-Endoscopische beoordeling van het Colon fenotype waargenomen in de loop van intestinale GVGH. Het serveert het bredere doel van het toelaten van wetenschappers die het bestuderen van intestinale GVGH lengterichting en noninvasively in de gehele ziekte loop (dat wil zeggen, vanaf het begin van het Colon manifestatie en de progressie tot maximale ziekte-activiteit).
Er zijn echter enkele kritische stappen en belangrijke beperkingen die…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de gezamenlijke onderzoek centra (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; project B03) (naar K.H.) en CRC 1181 (CRC-DFG, project B05) (naar K.H.), beide gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duits Research Foundation).
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
