Interfacing Mikrofluidik mit Mikroelektrode Arrays für das Studium neuronale Kommunikation und axonalen Signalausbreitung
Summary
Dieses Protokoll soll zeigen, wie in-vitro- Mikroelektrode Arrays mit mikrofluidischen Geräten für das Studium Aktionspotential Übertragung in neuronalen Kulturen zu verbinden. Datenanalyse, nämlich die Erkennung und Charakterisierung von Aktionspotentiale, Vermehrung ist durchgeführt mit einem neuen, erweiterten, aber benutzerfreundlich und frei verfügbar, computational Tool.
Abstract
Mikroelektrode Arrays (MEAs) werden häufig verwendet, um neuronale Funktion in-vitro-Studie. Diese Geräte ermöglichen gleichzeitige nichtinvasive Aufnahme/Stimulation der elektrophysiologischen Aktivität über einen längeren Zeitraum. Jedoch können Signale aus allen Quellen um jeden Mikroelektrode Sensing ungünstige Eigentum beim verstehen Kommunikation und Verbreitung in neuronalen Schaltkreisen zu signalisieren. In einem neuronalen Netzwerk mehrere Neuronen gleichzeitig aktivierbar und können überlappende Aktionspotentiale, macht es schwierig, zu diskriminieren und verfolgen Signalausbreitung erzeugen. In Anbetracht dieser Einschränkung haben wir eingerichtet, eine in-vitro- Setup konzentrierte sich auf die Bewertung von elektrophysiologischen Kommunikation, die in der Lage, zu isolieren und axonale Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verstärken. Durch Anbindung mikrofluidischen Geräten und MEAs, können wir neuronale Kulturen mit einem gut kontrollierten Ausrichtung der Axone und Mikroelektroden in Schubladen. Dieses Setup ermöglicht Aufnahmen von Spike Ausbreitung mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis im Laufe von mehreren Wochen. In Kombination mit speziellen Data-Analyse-Algorithmen, es bietet detaillierte Quantifizierung von mehreren Kommunikation im Zusammenhang mit Eigenschaften wie Ausbreitungsgeschwindigkeit, Wärmeleitung Versagen, Feuerrate, Anterograde Spitzen und Codierung Mechanismen.
Dieses Protokoll zeigt wie erstelle ich eine Setup unterteilte neuronalen Kultur über MEAs Substrat integriert, wie Neuronen in diesem Setup Kultur und wie erfolgreich aufzeichnen, analysieren und interpretieren die Ergebnisse solcher Experimente. Hier zeigen wir, wie die etablierten Einrichtung vereinfacht das Verständnis der neuronalen Kommunikation und axonalen Signalausbreitung. Diese Plattformen ebnen den Weg für neue in-vitro- Modelle mit engineered und steuerbare neuronalen Netzes Topografien. Sie können verwendet werden, im Zusammenhang mit der homogenen neuronalen Kulturen oder mit Kokultur Konfigurationen, z. B. Kommunikation zwischen sensorischen Neuronen und andere Zelltypen überwacht und bewertet wird. Diese Einrichtung bietet sehr interessante Konditionen zu studieren, zum Beispiel Neurodevelopment, neuronale Schaltkreise, Informationen Kodierung, Neurodegeneration und Neuroregeneration Ansätze.
Introduction
Verständnis elektrische Kommunikation in neuronalen Schaltkreisen ist ein grundlegender Schritt zur Normalfunktion zu offenbaren, und therapeutische Strategien um Funktionsstörungen zu beheben. Neuronen zu integrieren, zu berechnen und Relais Aktionspotentiale (APs), die sich entlang ihrer dünne Axone ausbreiten. Traditionelle elektrophysiologische Techniken (z.B. Patch-Clamp) sind leistungsfähige Techniken neuronalen Aktivität zu studieren, sondern beschränken sich oft auf die größeren Zellstrukturen, wie z. B. die Soma oder die Dendriten. Die bildgebenden Verfahren bieten eine Alternative zum axonale Signale mit hoher Ortsauflösung zu studieren, aber sie sind technisch schwierig zu führen und lassen keine langfristige Messungen1. In diesem Zusammenhang kann die Kombination von Mikroelektrode Arrays (MEAs) und Mikrofluidik einen mächtigen Beitrag bei der Offenlegung der grundlegenden Eigenschaften der Neuron´s Aktivität und Signal-Übertragung innerhalb neuronaler Netzwerke in-vitro-2 machen. , 3.
MEA-Technologie beruht auf extrazelluläre Aufnahmen von neuronalen Kulturen. Die Hauptvorteile dieser elektrophysiologische Methodik sind seine Fähigkeit, langfristige, gleichzeitige Stimulation und Aufnahme an mehreren Standorten und in eine nicht-invasive Weise3unterstützen. MEAs bestehen aus biokompatiblen, hoch leitfähige und korrosionsbeständig Mikroelektroden eingebettet in ein Glassubstrat Wafer. Sie sind kompatibel mit konventionellen Zelle Kultur Bio-Beschichtungen, die durch die Förderung von Zelladhäsion deutlich die Abdichtung zwischen dem Substrat und Zellen3,4zu erhöhen. Darüber hinaus sie sind vielseitig im Design und in Mikroelektroden Größe, Geometrie und Dichte variieren. Insgesamt arbeiten MEAs als konventionelle Zelle Kulturgefäße mit dem Vorteil, dass gleichzeitige live-Imaging und elektrophysiologische Aufnahmen/Stimulation.
Die Verwendung von MEA Technologie hat zum Studium der wichtigen Features von neuronalen Netzen5beigetragen. Es gibt jedoch inhärente Eigenschaften, die die Leistung von MEAs für das Studium Kommunikations- und APs Vermehrung in einem neuronalen Schaltkreis zu begrenzen. MEAs ermöglichen Aufnahmen von Einzelzellen und sogar subzellulären Strukturen wie Axone, aber im Vergleich zu somal Signale axonale Signale haben eine sehr geringe Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)6. Darüber hinaus behindert das Merkmal des extrazellulären Bereich Potenziale aus allen Quellen um jeden Mikroelektrode sensing das Tracking der Signalausbreitung in einem neuronalen Schaltkreis.
Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass bessere Aufnahmebedingungen erreicht werden können, indem er die Mikroelektroden im engen Mikrokanäle in die Axone wachsen können ausgerichtet. Diese Konfiguration bietet eine deutliche Zunahme der SNR, dass Vermehrung axonale Signale problemlos7,8,9,10,11,12erkannt, 13. Die Strategie von verbünden mikrofluidischen Geräten mit MEA Technologie schafft eine galvanisch getrennte Mikroumgebung geeignet, axonale Signale11zu verstärken. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren Fernerkundung Mikroelektroden entlang einer Mikrorille für Erkennung und Charakterisierung von axonalen Signalausbreitung von grundlegender Bedeutung.
In-vitro- Plattformen mit sehr kontrollierbar neuronalen Netzes Topografien können viele Forschung Fragen14angepasst. Diese Plattformen können sind geeignet, um im Rahmen der neuronalen Kulturen verwendet werden aber erweitert werden um Kokultur Konfigurationen, Ingenieur, wo die Kommunikation zwischen Nervenzellen und anderen Zelltypen überwacht und bewertet werden können. Diese Einrichtung bietet somit sehr interessante Konditionen, eine Reihe von neuronalen-bezogene Studien wie Neurodevelopment, neuronale Schaltkreise, Informationscodierung, Neurodegeneration und Neuroregeneration zu erkunden. Darüber hinaus kann die Kombination mit neuen Modellen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen15,16 neue Wege bei der Entwicklung von möglichen Therapien für Krankheiten des Menschen öffnen, die das Nervensystem beeinflussen.
Unser Labor ist diese Plattform kombinieren Mikroelektroden mit Mikrofluidik (µEF) verwenden, um neuronale Prozesse auf Zell- und Netzwerk Ebene und ihre Implikation in der Physio und pathologische Nervensystem zu verstehen. Angesichts des Wertes dieser Plattform auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, die dieses Protokoll soll demonstrieren, wie eine unterteilte neuronalen Evaluierungskultur über MEAs Substrat integriert, wie man Kultur Neuronen in dieser Plattform und wie man erfolgreich aufnehmen, analysieren Sie und interpretieren Sie die Ergebnisse solcher Experimente. Dieses Protokoll wird sicherlich die experimentellen Toolbox für neuronale Kulturen in der Erforschung der neuronalen Kommunikation bereichern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll zeigt wie ein µEF, bestehend aus einem Mikrofluidik-Gerät und ein MEA mit handelsüblichen Standardausführungen, zusammenzubauen und die erfassten Daten analysieren.
Beim Entwerfen eines Experiments müssen Forscher berücksichtigen, dass die in-vitro- Modell durch die MEA festen Raster, begrenzt ist, die Mikrorille Regelungen beschränkt. Die Verwendung eines bestimmten mikrofluidischen oder MEA Design richtet sich nach den spezifischen Bedürfniss…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde finanziert von FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento Regionalfonds durch COMPETE 2020 – Operacional Programm für Wettbewerbsfähigkeit und Internationalisierung (lt), Portugal 2020, und von den Portugiesen finanziert durch FCT – Fundação Para eine Ciência e eine Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (lt-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus wurde von FCT (PD/BD/135491/2018) unterstützt. Paulo Aguiar wurde von Programa Ciência – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – Förderung der wissenschaftlichen Beschäftigung, ESF und MCTES und Programm Investigador FCT, POPH und Fundo Social Europeu unterstützt. Die mikrofluidischen Geräte wurden bei INESC – Mikrosystem- und Nanotechnologie, Portugal, unter der Aufsicht von João Pedro Conde und Virginia Chu hergestellt.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
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