Microelectrode सरणियों के साथ Microfluidics संचार और Axonal सिग्नल प्रोपेगेशन का अध्ययन करने के लिए सामना करना पड़
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैसे इन विट्रो में गठबंधन करने के लिए microfluidic उपकरणों के साथ microelectrode arrays में कार्रवाई की क्षमता संचरण का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन संस्कृतियों । डेटा विश्लेषण, अर्थात् प्रचार कार्रवाई क्षमता का पता लगाने और लक्षण वर्णन, एक नया उंनत, अभी तक उपयोगकर्ता के अनुकूल है और आसानी से उपलब्ध है, गणना उपकरण का उपयोग किया जाता है ।
Abstract
Microelectrode arrays (रहत) व्यापक रूप से इन विट्रो मेंंयूरॉंस समारोह का अध्ययन किया जाता है । इन उपकरणों की अनुमति समवर्ती गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग/electrophysiological गतिविधि की लंबी अवधि के लिए । हालांकि, न्यूरॉन सर्किट में संचार और संकेत प्रचार को समझने की कोशिश कर रहा है जब हर microelectrode के आसपास के सभी स्रोतों से संकेत संवेदन की संपत्ति प्रतिकूल हो सकता है । एक ंयूरॉंस नेटवर्क में, कई ंयूरॉंस एक साथ सक्रिय किया जा सकता है और अतिव्यापी कार्रवाई क्षमता उत्पंन कर सकते हैं, यह मुश्किल भेदभाव करने के लिए और संकेत के प्रसार को ट्रैक कर । इस सीमा को ध्यान में रखते, हम एक इन विट्रो सेटअप electrophysiological संचार, जो अलग और उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ axonal संकेतों बढ़ाना करने में सक्षम है का आकलन करने पर ध्यान केंद्रित की स्थापना की है । microfluidic उपकरणों और रहत का सामना करके, हम axons और microelectrodes के एक अच्छी तरह से नियंत्रित संरेखण के साथ ंयूरॉन संस्कृतियों compartmentalize करने में सक्षम हैं । इस सेटअप कई हफ्तों के पाठ्यक्रम पर एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ स्पाइक प्रचार की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । विशेष डेटा विश्लेषण एल्गोरिदम के साथ संयुक्त, यह इस तरह के प्रसार वेग, आचरण विफलता, फायरिंग दर, anterograde spikes, और कोडिंग तंत्र के रूप में कई संचार संबंधित गुणों की विस्तृत ठहराव प्रदान करता है ।
इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे सब्सट्रेट पर एक compartmentalized ंयूरॉन संस्कृति सेटअप बनाने के लिए एकीकृत रहत, इस सेटअप में कैसे संस्कृति ंयूरॉंस के लिए, और कैसे सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए, विश्लेषण और इस तरह के प्रयोगों से परिणामों की व्याख्या । यहां, हम बताते है कि कैसे स्थापित सेटअप ंयूरॉन संचार और axonal संकेत प्रचार की समझ सरल । इन प्लेटफार्मों इंजीनियर और नियंत्रणीय ंयूरॉंस नेटवर्क स्थलाकृति के साथ इन विट्रो मॉडल में नए के लिए मार्ग प्रशस्त । वे सजातीय न्यूरॉन संस्कृतियों के संदर्भ में इस्तेमाल किया जा सकता है, या सह संस्कृति विन्यास के साथ जहां, उदाहरण के लिए, संवेदी न्यूरॉन्स और अन्य सेल प्रकार के बीच संचार निगरानी और मूल्यांकन किया जाता है. इस सेटअप का अध्ययन करने के लिए बहुत ही रोचक शर्तें प्रदान करता है, उदाहरण के लिए, neurodevelopment, न्यूरॉन सर्किट, जानकारी कोडिंग, neurodegeneration और neuroregeneration दृष्टिकोण.
Introduction
न्यूरॉन सर्किट में विद्युत संचार को समझना सामान्य कार्य प्रकट करने के लिए एक बुनियादी कदम है, और शिथिलता पता करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों ईजाद करना. न्यूरॉन्स एकीकृत, गणना और रिले कार्रवाई क्षमता (एपीएस) जो उनके पतले axons साथ प्रचार. पारंपरिक electrophysiological तकनीक (जैसे, पैच दबाना) शक्तिशाली तकनीक के लिए ंयूरॉंस गतिविधि का अध्ययन कर रहे है लेकिन अक्सर ऐसे सोमा या dendrites के रूप में बड़ा सेलुलर संरचनाओं, तक ही सीमित हैं । इमेजिंग तकनीक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ axonal संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन वे तकनीकी रूप से कठिन प्रदर्शन करते हैं और दीर्घकालिक माप1की अनुमति नहीं देते हैं । इस संदर्भ में, microelectrode arrays के संयोजन (रहत) और microfluidics ंयूरॉन ´ के मौलिक गुणों का खुलासा करने में एक शक्तिशाली योगदान कर सकते है गतिविधि और संकेत संचरण में न्यूरॉन नेटवर्क के भीतर इन विट्रो2 , 3.
मेे प्रौद्योगिकी न्यूरॉन संस्कृतियों की extracellular रिकॉर्डिंग पर निर्भर करता है । इस electrophysiological पद्धति का मुख्य लाभ कई साइटों पर लंबी अवधि, एक साथ उत्तेजना और रिकॉर्डिंग का समर्थन करने की क्षमता है और एक गैर इनवेसिव रास्ता3में । रहत एक गिलास वेफर सब्सट्रेट में एम्बेडेड, उच्च प्रवाहकीय और संक्षारण प्रतिरोधी microelectrodes के बने होते हैं । वे पारंपरिक कोशिका संस्कृति जैव कोटिंग्स के साथ संगत कर रहे हैं, जो सेल आसंजन को बढ़ावा देने के द्वारा काफी सब्सट्रेट और कोशिकाओं3,4के बीच सीलिंग प्रतिरोध वृद्धि हुई है । इसके अलावा, वे डिजाइन में बहुमुखी है और microelectrodes आकार, ज्यामिति और घनत्व में भिंन हो सकते हैं । कुल मिलाकर, समवर्ती जी इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग की अनुमति के लाभ के साथ पारंपरिक सेल संस्कृति जहाजों के रूप में काम रहत/
मेे प्रौद्योगिकी के उपयोग तंत्रिका नेटवर्क के महत्वपूर्ण सुविधाओं के अध्ययन के लिए योगदान दिया है5। हालांकि, वहां अंतर्निहित विशेषताएं है कि संचार और ए पी ए के प्रसार में अध्ययन के लिए रहत के प्रदर्शन की सीमा एक न्यूरॉन सर्किट । एकल कोशिकाओं से रहत सक्षम रिकॉर्डिंग और यहां तक कि axons की तरह उपसेलुलर संरचनाओं, लेकिन जब स्मल संकेतों की तुलना में, axonal संकेतों एक बहुत कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR)6है. इसके अलावा, हर microelectrode के आसपास सभी स्रोतों से extracellular क्षेत्र क्षमता संवेदन की विशेषता एक न्यूरॉन सर्किट में संकेत प्रसार की ट्रैकिंग में बाधा.
हाल के अध्ययनों का प्रदर्शन किया है, तथापि, कि बेहतर रिकॉर्डिंग शर्तों संकीर्ण microchannels में जो axons विकसित कर सकते है के भीतर गठबंधन microelectrodes होने से प्राप्त किया जा सकता है । इस विंयास SNR में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रदान करता है कि इस तरह के प्रचार axonal संकेतों को आसानी से पता लगाया जा सकता है7,8,9,10,11,12, 13. मेे प्रौद्योगिकी के साथ सहयोगी microfluidic उपकरणों की रणनीति एक विद्युत पृथक microenvironment axonal संकेतों11बढ़ाना उपयुक्त बनाता है । इसके अलावा, एक microgroove साथ कई संवेदन microelectrodes की उपस्थिति का पता लगाने और axonal संकेत प्रचार के लक्षण वर्णन के लिए मौलिक है ।
इन विट्रो प्लेटफार्मों में अत्यधिक नियंत्रणीय न्यूरॉन नेटवर्क स्थलाकृति के साथ कई शोध प्रश्न14के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इन प्लेटफार्मों ंयूरॉंस संस्कृतियों के संदर्भ में इस्तेमाल किया जा उपयुक्त हैं, लेकिन इंजीनियर सह संस्कृति विंयास, जहां ंयूरॉंस और अंय प्रकार के सेल के बीच संचार पर नजर रखी जा सकता है और मूल्यांकन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । इस प्रकार इस तरह के neurodevelopment, न्यूरॉन सर्किट, जानकारी कोडिंग, neurodegeneration और neuroregeneration के रूप में तंत्रिका से संबंधित अध्ययनों की एक संख्या का पता लगाने के लिए बहुत ही दिलचस्प शर्तों प्रदान करता है. इसके अलावा, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल15,16 के उभरते मॉडलों के साथ अपने संयोजन मानव रोगों है कि तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने के लिए संभावित उपचारों के विकास में नए रास्ते खोल सकते हैं ।
हमारी प्रयोगशाला microfluidics (µ ef) के साथ microelectrodes के संयोजन इस मंच का उपयोग कर रहा है सेलुलर और नेटवर्क के स्तर पर और फिजियो में उनके निहितार्थ-और रोग तंत्रिका तंत्र में ंयूरॉन प्रक्रियाओं को समझते हैं । तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में इस तरह के मंच के मूल्य को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैसे सब्सट्रेट पर एक compartmentalized ंयूरॉन संस्कृति बनाने के लिए एकीकृत रहत, इस मंच में कैसे संस्कृति ंयूरॉंस के लिए और कैसे सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए प्रदर्शित करने के लिए है, ऐसे प्रयोगों से परिणामों का विश्लेषण और व्याख्या करें. इस प्रोटोकॉल निश्चित रूप से तंत्रिका संचार के अध्ययन में ंयूरॉंस संस्कृतियों के लिए प्रयोगात्मक toolbox समृद्ध होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे एक µ ef इकट्ठा करने के लिए, एक microfluidic डिवाइस और मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिजाइनों के साथ एक मेे शामिल, और रिकॉर्ड किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए कैसे ।<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम FEDER-फंडो Europeu de Desenvolvimento क्षेत्रीय कोष द्वारा प्रतिस्पर्धा के लिए २०२०-Operacional कार्यक्रम के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था और अंतर्राष्ट्रीयकरण (POCI), पुर्तगाल २०२०, और पुर्तगाली धन द्वारा FCT के माध्यम से-Fundação पैरा एक Ciência ई ए Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino परियोजना के ढांचे में सुपीरियर PTDC/सीटीएम-नण/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-०१६६२३) । जोस सी Mateus FCT (पीडी/BD/135491/2018) द्वारा समर्थित किया गया था । पाउलो अगुइयार ने Programa Ciência-Programa Operacional पोटेंशीयल Humano (POPH)-वैज्ञानिक रोजगार, ESF और MCTES और कार्यक्रम Investigador FCT, POPH और फंडो सोशल Europeu को बढ़ावा देने का समर्थन किया था. microfluidic उपकरणों INESC-माइक्रोसिस्टंस और Nanotechnologies, पुर्तगाल, João पेड्रो Conde और वर्जीनिया चू के पर्यवेक्षण के तहत में गढ़े थे ।
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
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