神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース
Summary
このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。
Abstract
微小電極アレイ (Mea)生体外で神経機能研究に活躍しています。これらのデバイスは、長時間同時非侵襲的な記録/電気生理学的活性化を許可します。コミュニケーションを理解し、信号を神経回路網の伝搬しようとしたとき、すべての電極の周りのすべてのソースからの信号を検出のプロパティは不利ななります。神経ネットワークのいくつかのニューロンは、同時にアクティブにできるし、差別し、信号伝搬特性を追跡しにくく、重複する活動電位を生成することができます。この制限を考慮して分離し、高分解能を持つ軸索信号を増幅することができる電気生理学的コミュニケーションの評価に焦点を当てた体外セットアップを設けています。マイクロ流体デバイスと意味のインタ フェースで我々 は軸索と電極の配置の制御された神経の文化を区分することができます。このセットアップでは、数週間のコース上高い信号対雑音比とスパイクの伝搬の録音ができます。特殊なデータ解析アルゴリズムを組み合わせると、いくつかの通信の詳細な数量を提供しています前向性スパイク発火率、伝導障害伝播速度などの関連プロパティおよびコーディングのメカニズム。
このプロトコルは、基板統合測定上区分神経文化セットアップを作成する方法、このセットアップで神経細胞を培養する方法と正常に記録、分析およびそのような実験の結果を解釈する方法を示します。ここでは、神経回路および軸索の信号伝搬特性の理解を確立されたセットアップが簡略化する方法を示す.これらのプラットフォームは、ニューロン ネットワークの設計および制御可能な地形での in vitroモデルの新しい道を開きます。彼らは、同種の神経文化または共同文化構成、たとえば、感覚ニューロンと他の細胞型との間の通信は監視は、評価のコンテキストで使用できます。このセットアップは、神経発達、神経回路、コーディング、神経変性と再生に関するアプローチの情報を勉強する非常に興味深い状態を提供します。
Introduction
神経回路における電気通信を理解することは、通常の機能を明らかにし、機能不全に対処するための治療戦略を考案する基本的なステップです。ニューロンは、統合、計算し、細い軸索に沿って伝播活動電位 (APs) を中継します。従来の電気生理学的手法 (例えば、パッチク ランプ) は神経細胞の活動を研究するための強力な技術が、細胞体や樹状突起などのより大きい細胞構造に制限が多い。イメージング技術を提供高空間分解能、軸索信号を研究する代わりに、彼らが技術的に困難な実行し、長期の測定値1を許可しません。この文脈において微小電極アレイ (Mea) とマイクロ流体の組み合わせ2 培養神経回路網内の neuron´s 活動と信号伝送の基本特性を明らかに強力な貢献が出来る,3。
MEA 技術は、神経細胞培養の細胞外記録に依存します。この電気生理学的手法の主な利点は、長期的な同時刺激と非侵襲的方法3複数のサイトでの記録をサポートする能力です。Mea は、ガラス基板に埋め込まれた生体適合性、高い導電性と耐腐食性の電極から成っています。従来の携帯文化バイオ-コーティング、大幅細胞接着を促進することによって基板とセルの3,4間シールの抵抗になると互換性があります。また、彼らはデザインで汎用性が高く、電極のサイズ、形状、密度の異なる場合があります。全体的にみて、Mea は、同時のライブ イメージング、電気生理学的刺激の録音を許可の利点と従来の細胞培養容器として働きます。
MEA 技術の使用は、ニューラル ネットワークの5の重要な機能の研究に貢献しています。しかし、コミュニケーションと神経回路における Ap 伝搬を研究するため測定のパフォーマンスを制限する固有の機能があります。Mea は、単一細胞と軸索のようなも細胞レベル下の構造からの録音を有効にするが、ヒヨコの信号と比較して、軸索の信号を持って非常に低い信号対雑音比 (SNR)6。また、すべての電極の周りのすべてのソースからの細胞外の電位を感知の特徴は、神経回路の信号伝達特性のトラッキングを妨げます。
最近の研究より良い記録条件に軸索が育てることができる狭いマイクロ流路内で配置電極を持っていることによって得られること、ただし、実証しています。この構成により、sn 比の大幅な増加など、簡単にすることができます軸索信号を伝搬する検出7,8,9,10、11,12、 13。MEA 技術とマイクロ流体デバイスを同盟の戦略は、電気的に絶縁の微小環境軸索信号11を増幅する適切なを作成します。また、microgroove に沿って複数の検出電極の存在は軸索の信号伝搬特性の検出と評価のための基礎です。
ニューロン ネットワークの非常に制御可能な地形とそのような体外プラットフォームは、多くの研究の質問14に適応できます。これらのプラットフォームは神経文化のコンテキストで使用されること適したが、エンジニアの共同文化構成、神経細胞と他の細胞型との間の通信を監視および評価することができますに拡大することができます。このセットアップは、したがって多くの神経発達、神経回路、情報コーディング、神経変性と再生に関するなど神経関連研究を探検する非常に興味深い条件を提供します。さらに、ひと誘導多能性幹細胞15,16の新たなモデルとの組み合わせでは、神経系に影響を与える人間の病気のための潜在的な治療法の開発に新たな道を開くことができます。
私たちの研究室携帯電話やネットワークのレベルとその意義の生理・病態神経系で神経プロセスを理解する電極を組み合わせてマイクロ (µEF) このプラットフォームを使用してください。基板統合測定区分神経文化を作成する方法を示しますこの議定書の目的は、神経科学の分野でこのようなプラットフォームの値を指定すると、このプラットフォームで正常に録音する方法培養ニューロンの作り方分析し、そのような実験の結果を解釈します。このプロトコルは、情報伝達における神経文化の実験のツールボックスを豊かに確かに。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルは、記録されたデータを分析する方法と、µEF、マイクロ流体デバイスと標準的な市販デザイン、MEA の構成を組み立てる方法を示しています。
実験を設計するとき研究者考慮しなければならない体外モデルがマイクログルーブ手配を拘束 MEA 固定グリッドによって制限されること。特定のマイクロまたは MEA の設計の使用の実験的ニー?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フェダー – Fundo Europeu デ Desenvolvimento 競う 2020 年まで地域の資金によって融資された – FCT – カルーストを通じて競争力と国際化 (POCI)、ポルトガルの 2020 年とポルトガル語で Operacional プログラム資金パラ Ciência e、技術/Ministério da Ciência、技術 e Ensino 優れたプロジェクト PTDC/CTM-ナン/3146/2014 (POCI-01-0145-フェダー-016623) のフレームワーク。ホセ ・ C ・ マテウスは FCT (PD/BD/135491/2018 年) によって支えられました。サンパウロ aguiar 氏は、プログラム Ciência – プログラム Operacional ・ ・圏環境共生分野 (POPH) – 科学的な雇用促進、ESF と MCTES とプログラム Investigador FCT POPH とマイプ社会 Europeu によって支持されました。マイクロ流体デバイスをジョアン ペドロ コンデとバージニア州の朱の監督の下で INESC – サン ・ マイクロシス テムズ、ナノテクノロジー、ポルトガルで作製しました。
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
