Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación
Summary
Este protocolo pretende demostrar cómo combinar arreglos de microelectrodos en vitro con dispositivos microfluídicos para estudiar la transmisión del potencial de acción en cultivos neuronales. Análisis de los datos, es decir, la detección y caracterización de propagar potenciales de acción, es realizada con un nuevo avanzado, pero fácil de usar y libremente disponible, herramienta computacional.
Abstract
Arreglos de microelectrodos (MEAs) son ampliamente utilizados para el estudio de la función neuronal en vitro. Estos dispositivos permiten concurrente no invasivo grabación/estimulación de la actividad electrofisiológica durante largos períodos. Sin embargo, la característica de detección de señales de todas las fuentes alrededor de cada microelectrodo puede convertirse en desfavorable al tratar de entender la comunicación y propagación en circuitos neuronales de la señal. En una red neuronal, las neuronas varios pueden activarse simultáneamente y pueden generar potenciales de acción superpuestos, lo que hace difícil discriminar y propagación de las señales de pista. Teniendo en cuenta esta limitación, hemos establecido una configuración en vitro se centró en la evaluación electrofisiológica de comunicación, que es capaz de aislar y amplificar señales axonales con alta resolución espacial y temporal. Por interfaces dispositivos microfluídicos y MEAs, somos capaces de compartimentar las culturas neuronales con una alineación bien controlada de los axones y de microelectrodos. Esta configuración permite grabaciones de propagación de la espiga con un alto cociente signal-to-noise en el transcurso de varias semanas. En combinación con algoritmos de análisis de datos especializados, proporciona la cuantificación detallada de comunicación varias relacionadas con características tales como velocidad de propagación, falta de conducción, velocidad de disparo, picos anterógrada, codificación y mecanismos.
Este protocolo muestra cómo crear una configuración de cultura neuronal compartimentado sobre sustrato integrado MEAs, cómo las neuronas en esta configuración de la cultura y cómo con éxito registrar, analizar e interpretar los resultados de dichos experimentos. A continuación, os mostramos cómo la configuración establecida simplifica la comprensión de la comunicación neuronal y axonal señal propagación. Estas plataformas de allanan el camino para nuevos modelos en vitro con topografías ingeniería y controlable de la red neuronal. Pueden ser utilizados en el contexto de culturas neuronales homogéneas o con configuraciones de la cultura donde, por ejemplo, comunicación entre las neuronas sensoriales y otros tipos de células es monitoreada y evaluada. Esta configuración proporciona condiciones muy interesantes para estudiar, por ejemplo, neurodesarrollo, circuitos neuronales, información de codificación, métodos de neurodegeneración y Neurorregeneración.
Introduction
Entender la comunicación eléctrica en circuitos neuronales es un paso fundamental para revelar la función normal y diseñar estrategias terapéuticas para tratar la disfunción. Las neuronas integran, computan y transmitir potenciales de acción (APs) que se propagan a lo largo de sus axones delgados. Tradicionales técnicas electrofisiológicas (p. ej., abrazadera del remiendo) son técnicas poderosas para el estudio de la actividad neuronal, pero a menudo se limitan a las estructuras celulares más grandes, como el soma o las dendritas. Técnicas de imagen ofrecen una alternativa para estudiar señales axonales con alta resolución espacial, pero son técnicamente difíciles de realizar y no permita que las medidas a largo plazo1. En este contexto, la combinación de arreglos de microelectrodos (AMUMA) y microfluídica puede hacer una contribución de gran alcance en divulgar las propiedades fundamentales de transmisión de señal y actividad neuron´s dentro de las redes neuronales in vitro2 , 3.
Tecnología MEA se basa en grabaciones extracelulares de cultivos neuronales. Las principales ventajas de esta metodología electrofisiológica son su capacidad para apoyar la estimulación a largo plazo, simultánea y grabación en múltiples sitios y en una forma no invasiva3. Medidas se hacen de biocompatibles, de altas microelectrodos conductivos y resistente a la corrosión encajados un sustrato de oblea de vidrio. Son compatibles con celulares convencionales cultura bio-recubrimientos, que mediante la promoción de adhesión celular significativamente aumentar la resistencia de sellado entre el sustrato y células3,4. Además, son versátiles en el diseño y pueden variar en densidad, geometría y tamaño de microelectrodos. En general, MEAs trabajan como recipientes de cultivo celular convencional con la ventaja de permitir concurrentes en vivo-proyección de imagen y electrofisiológica grabaciones/estimulación.
El uso de la tecnología MEA ha contribuido al estudio de las características importantes de las redes neuronales5. Sin embargo, hay características inherentes que limitan el rendimiento de los AMUMA para estudiar comunicación y propagación de la APs en un circuito neuronal. MEAs permiten grabaciones de las células y estructuras subcelulares incluso como axones, pero en comparación con las señales de somal, axonales señales tienen una muy baja relación de señal a ruido (SNR)6. Por otra parte, la característica de detección de potenciales de campo extracelular de todas las fuentes alrededor de cada microelectrodo dificulta el seguimiento de la propagación de las señales en un circuito neuronal.
Sin embargo, estudios recientes han demostrado que se pueden conseguir mejores condiciones de grabación por tener los microelectrodos alineados dentro de microcanales estrecho en el cual pueden crecer los axones. Esta configuración proporciona un aumento significativo en el SNR que propagar señales axonales puede ser fácilmente detectado7,8,9,10,11,12, 13. La estrategia de aliarse dispositivos microfluídicos con tecnología MEA crea un microambiente aislado eléctricamente adecuado para amplificar señales axonal11. Por otra parte, la presencia de microelectrodos múltiples sensores a lo largo de un microsurco es fundamental para la detección y caracterización de propagación de las señales axonal.
Plataformas en vitro con topografías altamente controlable red neuronal pueden ser adaptadas a muchas preguntas de investigación14. Estas plataformas son adecuadas para usarse en el contexto de culturas neuronales pero se pueden ampliar para diseñar configuraciones de la cultura, donde se puede supervisar y evaluar la comunicación entre las neuronas y otros tipos de células. Así, esta configuración proporciona condiciones muy interesantes para explorar una serie de nervios-estudios relacionados con el neurodesarrollo, circuitos neuronales, codificación de la información, neurodegeneración y Neurorregeneración. Además, su combinación con los modelos emergentes de de15,de las células madre pluripotentes inducidas humanas16 puede abrir nuevos caminos en el desarrollo de terapias potenciales para enfermedades humanas que afectan el sistema nervioso.
Nuestro laboratorio está utilizando esta plataforma con microelectrodos de microfluídica (µEF) para comprender procesos neuronales a nivel celular y de red y su implicación en la fisio – y patológica del sistema nervioso. Dado el valor de dicha plataforma en el campo de la neurociencia, el propósito de este protocolo es demostrar cómo crear una cultura neuronal compartimentada sobre sustrato integrado MEAs, cómo las neuronas de la cultura en esta plataforma y cómo registrar con éxito, analizar e interpretar los resultados de dichos experimentos. Este protocolo sin duda enriquecerá la caja de herramientas experimental de cultivos neuronales en el estudio de la comunicación neuronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que presentamos muestra cómo montar un µEF, compuesto por un dispositivo de microfluidos y una MEA con diseños estándar disponibles comercialmente y cómo analizar los datos registrados.
Al diseñar un experimento, los investigadores deben tener en cuenta que el modelo de vitro está limitado por la rejilla fija de MEA, que restringe el microsurco arreglos. El uso de un particular microfluidos o MEA diseño dependerá de las necesidades experimentales pero, en general…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional fondos hasta el 2020 compiten – Operacional programa de competitividad e internacionalización (POCI), 2020 de Portugal y por portugueses fondos a través de la FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus fue apoyada por la FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar fue apoyado por el Programa Ciência – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – promoción del empleo científico, FSE y MCTES y programa Investigador FCT, POPH Fundo Social Europeu. Los dispositivos microfluídicos fueron fabricados en INESC – microsistemas y nanotecnologías, Portugal, bajo la supervisión de João Pedro Conde y Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
