Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스
Summary
이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.
Abstract
Microelectrode 배열 (MEAs) 널리 신경 기능에 생체 외에서연구 하는 데 사용 됩니다. 이 소자 들은 오랜 기간 동안 동시 비-침략 적 기록/자극 electrophysiological 활동의 허용. 그러나, 모든 microelectrode 주위 모든 소스 로부터 신호를 감지의 통신을 이해 하 고 신경 회로에 전파 신호를 하려고 할 때 불리 될 수 있다. 신경 네트워크에서 여러 뉴런 동시에 활성화 될 수 있다 하 고 차별 하 고 신호 전파를 추적 하 고 어려운 겹치는 활동 전위를 생성할 수 있습니다. 이 한계를 고려 하면 우리는 생체 외에서 설치 electrophysiological 통신, 격리 및 높은 공간 및 시간적 해상도 axonal 신호를 증폭 할 수 있는 평가에 초점을 맞춘을 설립 했다. 미세 장치 및 MEAs 인터페이스, 우리 신경 축 삭과 microelectrodes의 잘 제어 맞춤 문화 분류 수 있습니다. 이 설치는 몇 주에 걸쳐 높은 신호 대 잡음 비율 스파이크 전파의 녹음을 수 있습니다. 함께 전문된 데이터 분석 알고리즘, 그것 제공 합니다 여러 통신의 상세한 정량화 관련 전파 속도, 전도 장애, 발사 속도, 참가자 스파이크, 속성 및 메커니즘을 코딩.
이 프로토콜 기판 통합 MEAs에 compartmentalized 신경 문화 설치를 만드는 방법을,이 설정에서 뉴런 문화 하는 방법 및 성공적으로 기록, 분석 하 고, 같은 실험에서 결과 해석 하는 방법을 보여 줍니다. 여기, 우리가 설립된 설치 신경 통신 및 axonal 신호 전파의 이해를 단순화 하는 방법을 보여줍니다. 이러한 플랫폼 설계 하 고 관리할 수 있는 신경 네트워크 topographies와 새로운 생체 외에서 모델에 대 한 방법을 포장. 그들은 균질 신경 문화, 또는 공동 문화 구성, 예를 들어 감각 신경 세포와 다른 세포 유형 간의 통신은 모니터링 및 평가 컨텍스트에서 사용할 수 있습니다. 이 설치 매우 흥미로운 조건을 연구, 예를 들어 neurodevelopment, 신경 회로, 코딩, neurodegeneration 및 neuroregeneration 접근 하는 정보를 제공 합니다.
Introduction
신경 회로에 전기 통신 이해 정상적인 기능을 공개 하 고 역 기능을 해결 하기 위해 치료 전략을 고안 하는 기본 단계입니다. 신경 통합, 계산 및 활동 전위 (APs) 얇은 그들의 축 삭을 따라 전파를 릴레이. 전통적인 electrophysiological 기법 (예를 들어, 패치 클램프) 강력한 기술을 신경 활동을 공부 하지만 종종 soma 또는 모 수석 같은 큰 셀룰러 구조 제한. 높은 공간 해상도, axonal 신호를 공부 하는 대안을 제공 하는 이미징 기술을 하지만 그들은 기술적으로 어려운 수행 하 고 장기적인 측정1을 허용 하지 않습니다. 이러한 맥락에서 microelectrode 배열 (MEAs) 및 마이크로의 조합 공개 생체 외에서신경 네트워크2 내 neuron´s 활동 및 신호 전송의 기본적인 속성에 강력한 기여를 할 수 있습니다. , 3.
MEA 기술은 신경 문화의 extracellular 녹음에 의존합니다. 이 electrophysiological 방법론의 주요 장점은 장기, 동시 자극 및 기록 및 비-침략 적 방법3에 여러 사이트에서 지원 하는 기능입니다. MEAs 생체, 높은 전도성과 부식 방지 microelectrodes 유리 웨이퍼 기판에 만들어집니다. 그들은 기존의 셀 문화 바이오 코팅, 어떤 세포 접착을 크게 홍보 하 여 기판 및 셀3,4사이 봉인 저항 증가와 호환 됩니다. 또한, 그들은 디자인에서 다재 다능 한 그리고 microelectrodes 크기, 형상 및 밀도에 따라 달라질 수 있습니다. 전반적으로, MEAs 허용 동시 라이브 이미징 및 electrophysiological 녹음/자극의 장점과 함께 기존의 셀 문화 혈관으로 작동 합니다.
MEA 기술 사용 하 여 신경망5의 중요 한 특징의 연구에 기여 했다. 그러나, 통신 및 신경 회로에 Ap 전파 공부 MEAs의 성능을 제한 하는 고유의 기능이 있습니다. MEAs 단 세포와 축 삭, 같은 심지어 subcellular 구조에서 녹음 있지만 somal 신호에 비해, axonal 신호는 매우 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)6. 또한, 모든 microelectrode 주위 모든 소스에서 세포 외 필드 전위를 감지의 특성에는 신경 회로에 신호 전파의 추적 지장을 초래할 수 있습니다.
그러나 최근 학문은 설명 했다,, 더 나은 녹음 상태는 축 삭이 성장할 수 있는 좁은 microchannels 내 맞춤 microelectrodes 함으로써 달성 될 수 있다. 이러한 구성을 통해 SNR에 상당한 증가 쉽게 수 axonal 신호 전파 감지7,,89,10,11,12, 13. MEA 기술을 미세 장치를 점 락의 전략 axonal 신호11증폭에 적합 한 전기적으로 절연된 microenvironment를 만듭니다. 또한,는 microgroove 따라 여러 감지 microelectrodes의 존재 검출 및 axonal 신호 전파의 특성에 대 한 근본 이다.
높은 제어 신경 네트워크 topographies와 플랫폼 생체 외에서 이러한 많은 연구 질문14에 적용할 수 있습니다. 이러한 플랫폼 신경 문화의 맥락에서 사용 되 게 적당 하지만 공동 문화 구성, 신경 세포와 다른 세포 유형 간의 통신 감시 되 고 평가 될 수 있습니다 어디를 확장 될 수 있다. 이 설치는 따라서 매우 흥미로운 조건을 neurodevelopment, 신경 회로, 정보 코딩, neurodegeneration, neuroregeneration 등 신경 관련 연구의 여러 탐험을 제공 합니다. 또한, 인간 유도 만능 줄기 세포15,16 의 신흥 모델 조합 신 경계에 영향을 주는 인간의 질병을 위한 잠재적인 치료의 개발에 새로운 길을 열 수 있습니다.
우리의 실험실 셀룰러 및 네트워크 수준 및 물리 치료사 및 pathologic 신 경계에 그들의 암시에 신경 프로세스를 이해 하 마이크로 (µEF)와 microelectrodes을 결합 하는이 플랫폼을 사용 하는. 신경 과학의 분야에서 이러한 플랫폼의 가치를 감안할 때,이 프로토콜의 목적은 기판 통합 MEAs 전면 compartmentalized 신경 문화를 창조 하는 방법을 보여 주는 문화 신경이이 플랫폼에 성공적으로 기록 하는 방법 하는 방법 분석 하 고 이러한 실험에서 결과 해석. 이 프로토콜은 신경 통신의 연구에서 신경 문화에 대 한 실험 도구 상자 풍부 하 게 확실히 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 미세 장치 및 표준 상용 디자인, MEA의 구성 하는 µEF를 조립 하는 방법 및 기록된 데이터를 분석 하는 방법을 보여 줍니다.
실험을 설계할 때 연구 해야 고려 생체 외에서 모델 microgroove 준비 구속 MEA 고정된 격자에 의해 제한 됩니다. 특정 미세 또는 MEA 디자인을 사용 하 여 특정 실험적인 요구에 따라 달라 집니다 하지만, 일반적으로, 동일한 절?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 페더-경쟁 2020을 통해 푼도 최고 드 Desenvolvimento 지역 자금에 의해 융자 되었다-체제 프로그램 경쟁력 및 국제화 (POCI), 포르투갈 2020 그리고 포르투갈어에 의해 자금 FCT-Fundação 통해 파라 과학 전자는 기술 / Ministério 다 과학, 기술 전자 Ensino 우수한 PTDC/CTM-할머니/3146/2014 (POCI-01-0145-페더-016623) 프로젝트의 프레임 워크에서. 호세 C Mateus FCT (PD/BD/135491/2018)에 의해 지원 되었다. 파울로 Aguiar 과학적 고용의 프로그램이 과학-프로그램이 체제 Potencial Humano (POPH)-승진, ESF와 MCTES 및 프로그램 Investigador FCT, POPH 및 푼도 사회 최고에 의해 지원 되었다. 미세 소자 주앙 페드로 콘 데과 버지니아 추의 감독 아래 INESC-마이크로 및 나노기술, 포르투갈에서 조작 했다.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
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