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Neurosciences

स्वरांकन चित्रण और औषधीय लक्ष्यों के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और शक्तिशाली विधि के रूप में

Published: March 12, 2019
doi:
10.3791/58879
, , ,
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI,Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET,Copenhagen University Hospital

Summary

स्वतः आदिचित्रण की विधि का प्रयोग नियमित रूप से गुणात्मक या मात्रात्मक भेषजगुण के निर्धारण के लिए रेडियोलीगन्स के ऊतक वर्गों के लिए बाध्यकारी अध्ययन के लिए किया जाता है ।

Abstract

इन विट्रो स्वरलिपि का उद्देश्य प्रयोगात्मक पशुओं के साथ-साथ मनुष्यों से ऊतक में रुचि के एक प्रोटीन के संरचनात्मक वितरण की कल्पना करना है । विधि अपने जैविक लक्ष्य के लिए एक रेडियोलिगंड के विशिष्ट बंधन पर आधारित है । इसलिए, जमे हुए ऊतक वर्गों radioligand समाधान के साथ incubated हैं, और बाद में लक्ष्य के लिए बाध्यकारी रेडियोधर्मी क्षय का पता लगाने के द्वारा स्थानीयकृत है, उदाहरण के लिए, सहज फिल्म या भास्वर इमेजिंग प्लेटों का उपयोग करके. परिणामस्वरूप डिजिटल स्वतः adiograms उल्लेखनीय स्थानिक संकल्प है, जो परिमाणन और रेडियोलीजिंड के स्थानीयकरण अलग संरचनात्मक संरचनाओं में बाध्यकारी सक्षम बनाता है प्रदर्शन । इसके अलावा, परिमाणन वियोजन स्थिरांक (kd), निषेध स्थिरांक (ki) और साथ ही चयनित ऊतकों में बाइंडिंग साइटों (Bmax) के घनत्व के माध्यम से संलग्नी अपनत्व के औषधीय लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, विधि दोनों लक्ष्य स्थानीयकरण और संलग्नी चयनीयता के बारे में जानकारी प्रदान करता है । यहां, तकनीक उच्च संबध γ-hydroxybutyric एसिड (ghb) स्तनधारी मस्तिष्क ऊतक में बाध्यकारी साइटों की स्वतः आदिलेखी लक्षण वर्णन के साथ उदाहरण है, methodological बाध्यकारी परख के बारे में विचार पर विशेष जोर के साथ पैरामीटर्स, रेडियोलिगंड और डिटेक्शन विधि का चयन ।

Introduction

स्वत आदिचित्रण एक विधि है जो रेडियोधर्मी क्षय की छवियों को प्रदान करता है । तकनीक नियमित रूप से एक रेडियोलॉजिकल यौगिक और इसके लक्ष्य के बीच एक विशिष्ट औषधीय संपर्क के आधार पर विट्रो में ब्याज की एक प्रोटीन के ऊतक वितरण का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह लक्ष्य के लिए लिगल की चयनीयता के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान करता है । इन विट्रो स्वतः आदिचित्रण का उपयोग रेडियोलीगन्स के औषधीय बाध्यकारी मापदंडों के मात्रात्मक निर्धारण के लिए भी किया जा सकता है, जैसे वियोजन स्थिरांक (Kd) और बाइंडिंग साइटों का घनत्व (Bmax), साथ ही निर्धारित करने के लिए निषेध स्थिरांक (Ki) प्रतिस्पर्धा लिगंडस1,2. पारंपरिक homogenate रेडियोलिगंड बंधन की तुलना में, स्वत आदिचित्रण के लिए स्थानिक शरीर रचना विज्ञान कल्पना और क्षेत्रीय अभिव्यक्ति3पैटर्न के संक्षिप्त विवरण देने में सक्षम होने का फायदा है । स्वतः आदिचित्रण की विधि इसलिए immunocytochemistry के लिए एक प्रासंगिक विकल्प है, विशेष रूप से एक मान्य एंटीबॉडी के अभाव में. स्वत आदिचित्रण आसानी से एक मानक रेडियोआइसोटोप प्रयोगशाला में आवश्यक औषधीय विशिष्टता, ऊतक वर्गों की तैयारी के लिए एक माइक्रोटोम cryostat करने के लिए उपयोग, और एक उपयुक्त इमेजिंग के साथ एक उपयुक्त रेडियोलिगंड की उपलब्धता को देखते हुए कार्यान्वित किया जाता है डिवाइस है कि संबंधित ऊतक वर्गों में रेडियोधर्मिता के वितरण का विश्लेषण करने में सक्षम है. विशेष रूप से, रेडियोलिगंड के लिए एक महत्वपूर्ण चयन मापदंड गैर-लक्षित साइटों के लिए बाध्यकारी की एक सीमित मात्रा है । यह अन्य प्रोटीन, झिल्ली या सामग्री जैसे प्लास्टिक या फिल्टर के लिए हो सकता है, और सामूहिक रूप से गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के रूप में संदर्भित किया जाता है । आमतौर पर, गैर विशिष्ट बाध्यकारी गैर है, लेकिन संतृप्त किया जा सकता है अगर यह एक विशिष्ट बंद लक्ष्य प्रोटीन शामिल है । सही विशिष्ट बाध्यकारी मान्य करने का सबसे अच्छा तरीका है लक्ष्य की कमी ऊतकों की तुलना करने के लिए है, उदा, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर (नॉक आउट) ऊतक4.

यहां, इस पद्धति को स्तनधारी मस्तिष्क में γ-हाइड्रोक्सीब्यूटिरिक एसिड (ghb) के लिए उच्च-संबध बाइंडिंग साइट के ऑटोराडियोग्राफिक लक्षण वर्णन के साथ सचित्र है । ghb और उसके बाध्यकारी साइट के बीच औषधीय बातचीत को समझना ghb के रूप में प्रासंगिकता का है दोनों narcolepsy और शराब5के उपचार में एक चिकित्सकीय उपयोगी दवा है, लेकिन यह भी स्तनधारी मस्तिष्क का एक प्राकृतिक घटक और एक मनोरंजक औषध६. उच्च बंधुत्व ghb बाध्यकारी साइटों पहले [3ज] का उपयोग कर वर्णित किया गया ghb चूहा मस्तिष्क के लिए बाध्यकारी7homogenate । पिछले कुछ वर्षों में, [3ज] ghb और एनालॉग [3एच] ncs-३८२ के साथ आगे स्वतः आदिचित्रण अध्ययन चूहा8,9,10, माउस9 के अग्र मस्तिष्क क्षेत्रों में बाध्यकारी साइटों की एक उच्च घनत्व से पता चला है , सुअर11और बंदर/ हालांकि, आणविक पहचान और इन बाध्यकारी साइटों की सटीक कार्यात्मक प्रासंगिकता मायावी बनी हुई है ।

आगे बाध्यकारी साइटों की विशेषता के इरादे के साथ, और ghb की शारीरिक भूमिका पर अध्ययन की सुविधा के लिए, कई विभिंन बंधुता के साथ संपंन आइसोटोप शामिल रेडियोलीगन्स विकसित किया गया है ([3ज] ghb, [3 h] ncs-३८२, [3h] हॉपीसीए और [१२५I] bnoph-ghb)13,14,15,16(17में समीक्षित) (चित्रा 1) । चयनात्मक उच्च-अपनत्व रेडियोलीगन्स के संयोजन और बाध्यकारी साइटों की एक बहुत ही उच्च ऊतक घनत्व भास्वर इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों के उत्पादन के लिए अनुमति दी है9,11. एक स्वतः एडिग्राफिक प्रयोग और एक उदाहरण की स्थापना में व्यावहारिक अंक की रूपरेखा के साथ साथ विवरण उदाहरण के लिए, चर्चा अनुभाग मैं जोर देंगे) radionuclide के विकल्प, द्वितीय) परख शर्तों के विकल्प, और iii) फ़ॉस्फ़र का उपयोग एक्स-रे फिल्म बनाम इमेजिंग प्लेट्स । इस पत्र का समग्र लक्ष्य ऊतक वितरण और प्रोटीन लक्ष्यों के औषधीय विश्लेषण के बारे में सूचित करने के लिए ऑटोएडिग्राफी तकनीक पर तकनीकी, methodological और वैज्ञानिक विवरण प्रदान करना है ।

Protocol

सभी पशु हैंडलिंग डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय से दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया था । नोट: प्रोटोकॉल यहां वर्णित ऊतक तैयारी को शामिल किया गया (यानी, माउस मस्तिष्क ऊतक), एक नई प्रयोग?…

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, उच्च-बंधुत्व ghb बाइंडिंग साइटों का संरचनात्मक वितरण, माउस मस्तिष्क में, जो कि कोरोनल, समतलीय और क्षैतिज वर्गों में काटा गया था, रेडियोलाबटेंड ghb एनालॉग [3…

Discussion

एक स्वतः आदिलेखी परख की गुणवत्ता अक्सर रेडियोलिगंड की संवेदनशीलता से निर्धारित होता है । एक प्रमुख योगदान कारक चयनित रेडियोआइसोटोप है, जो ज्ञात लिगन्स की उपलब्धता द्वारा या विशिष्ट लेबलिंग तकनीकों ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

काम lundbeck फाउंडेशन (अनुदान R133-A12270) और novo nordisk फाउंडेशन (अनुदान NNF0C0028664) द्वारा समर्थित किया गया था । लेखकों [3एच] रेडियोलिगंड की आपूर्ति के लिए डॉ aleš मारेक धन्यवाद.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597
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AutoradiographyProtein BindingPharmacological TargetsCryostat SectioningRadioligand LabelingNon-specific BindingSpatial ResolutionDigital ImagingPharmacological Analysis
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Citer Cet Article
Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).
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