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Neurosciences

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

Published: March 12, 2019
doi:
10.3791/58879
, , ,
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI,Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET,Copenhagen University Hospital

Summary

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

Abstract

Autoradiography 생체 외에서 인간 뿐만 아니라 실험 동물에서 조직에 관심사의 단백질의 해부학 적 분포를 시각화 하는 것을 목표로. 메서드를 생물 학적 대상 radioligand의 특정 바인딩을 기반으로 합니다. 따라서, 언된 조직 단면도 radioligand 솔루션, 알을 품는 그리고 대상 바인딩 이후 지역화 방사성 붕괴의 탐지에 의해 예를 들어 감광 필름 또는 인광 체 격판덮개를 이미징 사용 하 여. 결과 디지털 autoradiograms 정량화 및 지역화 radioligand 바인딩 다른 해 부 구조에서의 놀라운 공간 해상도 표시 합니다. 또한, 정량화 바인딩 사이트 (B최대) 선택 된 조직에서의 밀도 뿐만 아니라 분리 상수 (Kd), (K나) 저해 상수에 의하여 ligand 선호도 약리 특성에 대 한 수 있습니다. 따라서, 메서드는 대상 지역화 및 리간드 선택에 대 한 정보를 제공합니다. 여기, 기술은 높은 선호도 γ-hydroxybutyric 산 (GHB) 바인딩 바인딩 분석 결과 관한 방법론 고려 사항에 특별 한 강조와 포유류 뇌 조직에서 사이트의 autoradiographic 묘사와 궁 행 매개 변수는 radioligand 및 검출 방법의 선택.

Introduction

Autoradiography는 방사성 붕괴의 이미지를 제공 하는 방법입니다. 기술은은 정기적으로 관심 생체 외에서 기반 radiolabelled 화합물과 그 대상 간의 특정 약물 상호 작용에의 한 단백질의 조직 분포를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 대상에 대 한는 리간드의 선택도 대 한 직접적인 정보를 제공합니다. 생체 외에서 autoradiography도 사용할 수 있습니다 결정 뿐만 아니라 약리 바인딩 매개 변수 분리 상수 (Kd) 및 (B최대), 바인딩 사이트의 밀도 같은 radioligands의 양적 결정 경쟁 ligands1,2의 저해 상수 (Ki). 전통적인 homogenate radioligand 바인딩에 비해 autoradiography 공간 해부학을 시각화 수 있는 그리고 지역 식 패턴3의 간결 상세히의 이점이 있다. Autoradiography 방법 따라서 검증 된 항 체의 부재에 (서) 특히 immunocytochemistry에 관련 대안입니다. Autoradiography 쉽게 필요한 약리학 특이성, 톰 cryostat 준비 조직 단면도, 및 적합 한 이미징에 대 한 액세스와 함께 적합 한 radioligand의 가용성을 주어진 표준 방사성 동위 원소 실험실에서 구현 각 조직 섹션에서 방사능의 분포를 분석할 수 있는 장치. 특히,는 radioligand에 대 한 중요 한 선택 기준이 아닌 대상 사이트에 바인딩 제한 금액입니다. 이 다른 단백질, 세포 막 또는 플라스틱 또는 필터, 등 자료 수 있으며 일반적인 바인딩 통칭. 일반적으로, 비 특정 바인딩 비 있는 하지만 있는 특정 오프 대상 단백질을 포함 될 수 있습니다. 사실 특정 바인딩 유효성을 검사 하는 가장 좋은 방법은 조직 부족 대상, 예를 들면, 유전자를 비교 (녹아웃) 조직4설계 된다.

여기, 방법론은 포유류 두뇌에서 γ-hydroxybutyric acid (GHB)의 높은 친 화력 바인딩 사이트의 autoradiographic 묘사와 그림입니다. GHB는 narcolepsy 및 알코올 중독5, 치료 뿐만 아니라 포유류 두뇌와는 레크리에이션의 자연 구성 모두 임상적으로 유용한 약물 관련성의 이다 GHB와 그것의 바인딩 사이트 간의 약리 상호 작용 이해 약6. 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트 처음 쥐 뇌 homogenate7[3H] GHB 바인딩을 사용 하 여 설명 했다. 년 동안, 더 autoradiography 연구 [3H] GHB와 아날로그 [3H] NCS 382 바인딩 사이트 쥐8,,910, 마우스9 개 지역에서의 높은 밀도 보였다는 11와 원숭이/인간 두뇌12돼지. 그러나, 분자 정체성과 이러한 바인딩 사이트의 정확한 기능 관련성은 애매 남아 있다.

의도 바인딩 사이트 추가 하 고 GHB의 생리 적 역할에 대 한 연구를 촉진 하기 위하여, 다른 동위 원소 다른 선호도 부여를 통합 하는 여러 radioligands 개발 되었습니다 ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA와 [125나] BnOPh GHB)13,,1415,16(17에서 검토) (그림 1). 선택적인 높은 선호도 radioligands와 바인딩 사이트 이미징 기술9,11형광체를 사용 하 여 높은-품질 이미지의 생산에 대 한 허용의 매우 높은 조직 밀도의 조합. 세부를 예증 하는 autoradiographic 실험 및 그림 설정에 실용적인 포인트의 개요, 함께 토론 섹션의 방사성 핵 종 i) 선택, ii) 분석 결과 조건, 선택 및 iii) 형광체의 사용을 강조 합니다. x 선 필름 대 이미징 접시입니다. 이 종이의 전반적인 목표는 조직 분포 및 단백질 목표의 약리학 분석에 대 한 알리는 autoradiography 기술에 기술, 방법론 및 과학적인 세부 사항을 제공.

Protocol

모든 동물 처리 덴마크어 동물 실험 검사자에서 지침에 따라 수행 되었다. 참고: 여기에 설명 된 프로토콜 커버 조직 준비 (즉, 마우스 뇌 조직), 생체 외에서 autoradiographic 분석 결과 새로운 실험실에서 메서드, 인광 체 격판덮개를 이미징에 노출 설정에 대 한 충분 한 세부 사항에서 뿐만 아니라 지역화 및 다른 해 부 구조에 radioligand 바인딩 측정의 목적으로 autorad…

Representative Results

설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트의 해부학 적 분포 radiolabelled GHB 아날로그 [3H] 함께 가시화 했다 코로나, 화살 및 수평 섹션 (그림 3으로 잘 렸는 쥐의 뇌에 HOCPCA ). 높은 수준의 바인딩 해 마와 대뇌 피 질에서 관찰 되었다가 낮은 바인딩 및 바인딩 없음 검색 되었습니다, 소 뇌에 해당 하는 높은 선호도 GHB 사이트<…

Discussion

Autoradiographic 분석 결과의 품질은 가장 자주는 radioligand의 감도 의해 결정 됩니다. 주요 기여 하는 요소는 적절 한 특정 활동 (즉, 방사능의 양을 ligands를 알려진된 ligands의 가용성에 의해 또는 특정 라벨 기술의 타당성에 의해 주어진 선택 된 방사성 동위 원소 단위는 radioligand의 두더지) 당23와 화학 저하의 제한 금액. 알려진된 ligands의 radioligands의 많은 수는 움…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

작품은 Lundbeck 재단 (그랜트 R133-A12270), Novo Nordisk 기초 (그랜트 NNF0C0028664)에 의해 지원 되었다. 저자 [3H] radioligand의 공급에 대 한 박사 Aleš 마렉을 감사합니다.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597
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AutoradiographyProtein BindingPharmacological TargetsCryostat SectioningRadioligand LabelingNon-specific BindingSpatial ResolutionDigital ImagingPharmacological Analysis
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Citer Cet Article
Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).
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