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Chimie

escherichiaकोलाई आधारित सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण: एक मजबूत, लचीला, और सुलभ मंच प्रौद्योगिकी के लिए प्रोटोकॉल

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

इस प्रोटोकॉल के चरण, लागत, और ई.कोलाई आधारित सेल निष्कर्षों को उत्पंन करने और 4 दिन या उससे कम के भीतर विट्रो प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में लागू करने के लिए आवश्यक उपकरणों का विवरण । व्यापक अनुप्रयोगों के लिए इस मंच के लचीला प्रकृति का लाभ उठाने के लिए, हम प्रतिक्रिया की स्थिति है कि अनुकूलित और अनुकूलित किया जा सकता है पर चर्चा की ।

Abstract

पिछले ५० वर्षों में, सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (cfps) एक परीक्षण ट्यूब के भीतर कोशिकाओं की transcriptional और शोधों क्षमता का दोहन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है । सेल की व्यवहार्यता को बनाए रखने की आवश्यकता को दूर करके, और सेलुलर बैरियर को नष्ट करके, cfps को परंपरागत रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटीन के बायोन्युफैक्चरिंग में उभरते अनुप्रयोगों के लिए मूलभूत किया गया है, साथ ही आवेदन रैपिड प्रोटोटाइप में चयापचय इंजीनियरिंग, और कार्यात्मक जीनोमिक्स । एक ई.कोलाई आधारित cfps मंच को लागू करने के लिए हमारे तरीके नए उपयोगकर्ताओं को इन आवेदनों में से कई का उपयोग करने की अनुमति । यहां, हम तरीकों का वर्णन करने के लिए समृद्ध मीडिया के उपयोग के माध्यम से निकालने तैयार, चकरा देना flasks है, और एक reproducible विधि ट्यून sonication-आधारित सेल lysis । इस उद्धरण तो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पादन में सक्षम ९०० μg/mL या सुपर फ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अधिक (sfgfp) प्रायोगिक सेटअप से डेटा विश्लेषण करने के लिए सिर्फ 5 ज में, यह देखते हुए कि उपयुक्त अभिकर्मक स्टॉक पहले से तैयार किया गया है. अभिकर्मकों को प्राप्त करने की अनुमानित लागत $४,५०० है जो प्रति μg प्रोटीन की अनुमानित लागत पर हजारों प्रतिक्रियाओं का उत्पादन या $०.०१९ प्रति μl की प्रतिक्रिया को बनाए रखेंगे । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति तरीके प्रतिक्रिया सेटअप की आसानी दर्पण अभिकर्मक पूर्व घोला जा सकता है के अनुकूलन के कारण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों में देखा, लागत का एक अंश पर । आदेश में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए cfps मंच के लचीला प्रकृति का लाभ उठाने के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए, हम मंच है कि tuned किया जा सकता है और उपलब्ध संसाधनों और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिणामों के आधार पर अनुकूलित के पहलुओं की एक किस्म की पहचान की है वांछित.

Introduction

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (cfps) एक तकनीक है कि प्रोटीन उत्पादन के लिए नए अवसरों के एक नंबर खुला है के रूप में उभरा है, कार्यात्मक जीनोमिक्स, चयापचय इंजीनियरिंग, और अधिक पिछले ५० वर्षों के भीतर1,2. vivo प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लेटफार्मों में मानक की तुलना में , cfps तीन प्रमुख लाभ प्रदान करता है: 1) मंच के सेल मुक्त प्रकृति प्रोटीन है कि संभावित विषाक्त या सेल3,4 के लिए विदेशी होगा के उत्पादन में सक्षम बनाता है ,5,6; 2) जीनोमिक डीएनए की निष्क्रियता और एक टेम्पलेट डीएनए का परिचय प्रोटीन (ब्याज) के उत्पादन के लिए प्रतिक्रिया के भीतर प्रणालीगत ऊर्जा के जीन (ओं) को इनकोडिंग करते हैं; और 3) मंच की खुली प्रकृति को संशोधित करने और वास्तविक समय7,8में प्रतिक्रिया की स्थिति और संरचना की निगरानी करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है । प्रतिक्रिया करने के लिए यह सीधी पहुँच विस्तार chemistries और उपन्यास प्रोटीन के उत्पादन के लिए रेडॉक्स शर्तों और चयापचय प्रक्रियाओं की ट्यूनिंग के साथ जैविक प्रणालियों के विस्तार का समर्थन करता है2,9, 10. डायरेक्ट एक्सेस भी उपयोगकर्ता अधिक तेजी से डिजाइन के लिए एक एकल बर्तन प्रणाली में गतिविधि assays के साथ cfps प्रतिक्रिया गठबंधन करने के लिए अनुमति देता है-निर्माण परीक्षण11चक्र । छोटी मात्रा बूंदों में या कागज आधारित उपकरणों पर cfps प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने की क्षमता आगे उच्च throughput खोज प्रयासों और रैपिड प्रोटोटाइप12,13,14,15 का समर्थन करता है ,16. इन लाभों और प्रणाली के प्लग और खेल प्रकृति का एक परिणाम के रूप में, cfps अद्वितीय है कि विवो 17 मेंsolubly व्यक्त करने के लिए मुश्किल है प्रोटीन के उत्पादन के रूप में जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म सक्षम है, 18,19,20, रोग का पतालगाना 21,22,23, मांग पर बायोन्युफैक्चरिंग18,24 ,25,26,27, और शिक्षा28,29, जो सभी के लचीलेपन और सेल मुक्त मंच की उपयोगिता दिखा ।

cfps सिस्टम प्रोकार्योटिक और यूकार्योटिक सेल लाइनों दोनों से क्रूड लाइजेट्स की एक किस्म से उत्पन्न किया जा सकता है । यह पसंद की प्रणाली में विविध विकल्पों के लिए अनुमति देता है, जिनमें से प्रत्येक ब्याज के आवेदन के आधार पर लाभ और नुकसान है । cfps सिस्टम भी तैयारी समय, लागत, और उत्पादकता में काफी भिंनता है । सबसे अधिक उपयोग सेल अर्क गेहूं रोगाणु से उत्पादित कर रहे हैं, खरगोश जालीदार, कीट कोशिकाओं, और escherichia कोलाई कोशिकाओं, बाद के साथ सबसे अधिक लागत प्रभावी तिथि करने के लिए किया जा रहा है, जबकि प्रोटीन के उच्चतम volumetric पैदावार का उत्पादन30 . जबकि अंय cfps प्रणालियों उनके जंमजात के बाद translational संशोधन मशीनरी के लिए फायदेमंद हो सकता है, उभरते अनुप्रयोगों ई.कोलाई आधारित मशीनरी का उपयोग कर साइट पैदा करने के अंतर को पाटने में सक्षम है-विशेष रूप से फ़ॉस्फॉल्लेटेड और मांग पर ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन31,३२,३३,३४,३५.

cfps प्रतिक्रियाओं या तो बैच, सतत-विनिमय सेल मुक्त (cecf) या सतत प्रवाह सेल मुक्त (cfps) स्वरूपों में चलाया जा सकता है । बैच प्रारूप एक बंद प्रणाली जिसका रिएक्शन जीवनकाल reactants की मात्रा कम और प्रतिक्रिया के निरोधात्मक byproducts के संचय के कारण सीमित है । cecf और cfcf तरीकों प्रतिक्रिया के जीवनकाल में वृद्धि, और इस तरह बैच प्रतिक्रिया की तुलना में वृद्धि हुई volumetric प्रोटीन पैदावार में परिणाम. यह प्रोटीन संश्लेषण के byproducts प्रतिक्रिया पोत से हटा दिया है, जबकि नए reactants प्रतिक्रिया2के दौरान आपूर्ति की अनुमति से पूरा किया है । cfcf के मामले में, ब्याज की प्रोटीन भी रिएक्शन चैंबर से हटाया जा सकता है, जबकि cecf में, ब्याज की प्रोटीन एक अर्द्ध पारगम्य झिल्ली३६,३७के शामिल रिएक्शन चैंबर में रहता है. इन तरीकों को विशेष रूप से मुश्किल से व्यक्त प्रोटीन की गरीब volumetric पैदावार पर काबू पाने में मूल्यवान है ब्याज३८,३९,४०,४१,४२, ४३. cecf और cfcf दृष्टिकोण को लागू करने में चुनौतियां है कि 1) जब वे प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए जिंमेदार जैव मशीनरी के अधिक कुशल उपयोग में परिणाम, वे विशेष रूप से अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है कि समग्र लागत और 2 बढ़ जाती है) वे बैच प्रारूप४४की तुलना में अधिक जटिल प्रतिक्रिया setups और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । आदेश में नए उपयोगकर्ताओं के लिए पहुंच सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल इस के साथ साथ वर्णन पर ध्यान केंद्रित बैच प्रारूप पर 15 μl की प्रतिक्रिया मात्रा में वृद्धि के लिए विशिष्ट सिफारिशों के साथ milliliter स्केल.

इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों गैर विशेषज्ञों को सक्षम बुनियादी प्रयोगशाला कौशल के साथ (जैसे स्नातक छात्रों के रूप में) सेल विकास को लागू करने के लिए, निकालने की तैयारी, और बैच प्रारूप प्रतिक्रिया सेटअप एक ई.कोलाई आधारित cfps प्रणाली के लिए । इस दृष्टिकोण किट आधारित प्रतिक्रिया सेटअप की आसानी त्याग के बिना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की तुलना में लागत प्रभावी है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रयोगशाला में अनुप्रयोगों और क्षेत्र में सक्षम बनाता है । जब cfps को लागू करने का निर्णय लेने, नए उपयोगकर्ताओं को अच्छी तरह से स्टार्टअप निवेश के लिए पारंपरिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना चाहिए, के रूप में cfps हर मामले में बेहतर नहीं हो सकता है । cfps तरीकों यहां वर्णित उपयोगकर्ता सीधे कार्यात्मक जीनोमिक्स, उच्च throughput परीक्षण, प्रोटीन है कि विवो अभिव्यक्ति में के लिए असभ्य हैं, साथ ही क्षेत्र के उत्पादन सहित, अनुप्रयोगों की एक किस्म को लागू करने के लिए सक्षम सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एन्टीजन और शैक्षिक किट सहित आवेदन. इस तरह के चयापचय इंजीनियरिंग के रूप में अतिरिक्त आवेदन, प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थिति की ट्यूनिंग, रोग का पता लगाने, और स्केल-अप cecf या cfcf तरीकों का उपयोग अभी भी संभव है, लेकिन प्रतिक्रिया के आगे संशोधन के लिए cfcf मंच के साथ अनुभव की आवश्यकता हो सकती है शर्तों. हमारे तरीकों को समृद्ध मीडिया में विकास गठबंधन और चकित flasks, अपेक्षाकृत तेजी से और reproducible sonication के माध्यम से सेल lysis के तरीकों के साथ, एक सरलीकृत cfps प्रतिक्रिया सेटअप द्वारा पीछा किया कि अनुकूलित premixes४५का इस्तेमाल करता है । जबकि सेलुलर विकास के तरीकों को कुछ हद तक इस क्षेत्र में मानकीकृत हो गए हैं, सेल lysis के लिए तरीके व्यापक रूप से बदलती हैं । sonication के अलावा, आम lysis तरीकों एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग शामिल, एक homogenizer, मनका मनका, या लाइसोजाइम और अंय जैव रासायनिक और शारीरिक व्यवधान तरीकों४६,४७,४८, ४९. हमारे तरीकों का उपयोग करते हुए, लगभग 2 मिलीलीटर कच्चे सेल निकालने की कोशिकाओं के 1 एल प्रति प्राप्त कर रहे हैं । सेल निकालने की इस मात्रा का समर्थन कर सकते हैं ४१५ μl cfps प्रतिक्रियाओं, प्रत्येक उत्पादन ~ ९०० μg/एमएल टेंपलेट से रिपोर्टर sfgfp प्रोटीन प्लाज्मिड pJL1-sfgfp । इस विधि की लागत $0.021/μg of sfgfp उत्पादित ($. 019/μl की प्रतिक्रिया), श्रम और उपकरणों की लागत को छोड़कर (पूरक चित्रा 1). खरोंच से शुरू, इस विधि एक ही व्यक्ति द्वारा 4 दिनों में लागू किया जा सकता है और दोहराने cfps प्रतिक्रियाओं घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है (1 चित्रा) । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुरूप करने के लिए अभिकर्मक तैयारी के बड़े बैच के लिए मात्रा में बढ़ाया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला द्वारा कार्यांवित किया जा सकता है प्रशिक्षित गैर विशेषज्ञों जैसे स्नातक छात्रों के रूप में, यह केवल बुनियादी प्रयोगशाला कौशल की आवश्यकता है । नीचे वर्णित प्रक्रियाओं, और साथ वीडियो विशेष रूप से व्यापक उपयोग के लिए ई. कोली cfps मंच की पहुंच में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है ।

Protocol

1. मीडिया तैयारी और सेल विकास Day 1 स्ट्रीक ई. कोलाई BL21 * (DE3) एक ग्लिसरोल स्टॉक से एक पौंड आगर प्लेट पर कोशिकाओं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर कम से 18 एच के लिए सेते हैं । पौंड मीडिया की ५० मिलीली?…

Representative Results

हम एक sonication आधारित ई. कोलाई निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल है कि एक चार दिन की अवधि में पूरा किया जा सकता है प्रस्तुत किया है, चित्रा 1 प्रत्येक दिन पर प्रक्रियात्मक टूटने का प्रदर?…

Discussion

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण जैव रासायनिक प्रणालियों के तेजी से प्रोटोटाइप बायोमानुफैक्चरिंग से लेकर आवेदनों की एक किस्म के लिए एक शक्तिशाली और सक्षम करने के लिए प्रौद्योगिकी के रूप में उभरा है । आवेद…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक Dr. जेनिफर vanderkelen, एंड्रिआ laubscher, और तकनीकी सहायता के लिए टोनी ट्रेटो, wesley काओ, layne विलियंस, और क्रिस्टोफर hight सहायक विचार विमर्श के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक भी बिल और लिंडा फ्रॉस्ट कोष, जैव प्रौद्योगिकी धरण जैव प्रौद्योगिकी में आवेदन के लिए केंद्र अनुसंधान बंदोबस्ती अनुदान, काल पाली अनुसंधान, विद्वानों, और रचनात्मक गतिविधियों अनुदान कार्यक्रम (rsca २०१७) से अनुदान समर्थन स्वीकार करते हैं, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (nsf-१७०८९१९) । mzl कैलिफोर्निया राज्य विश्वविद्यालय के स्नातक अनुदान स्वीकार करता है । mcj स्वीकार करता है सेना के अनुसंधान कार्यालय W911NF-16-1-0372, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान mcj-१४१३५६३ और mcj-१७१६७६६, वायु सेना के अनुसंधान प्रयोगशाला उत्कृष्टता अनुदान FA8650-15-2-5518 के केंद्र, रक्षा खतरे में कमी एजेंसी अनुदान HDTRA1-15-10052/P00001, डेविड और lucile packard फाउंडेशन, केमिली dreyfus शिक्षक-विद्वान कार्यक्रम, ऊर्जा मांक अनुदान DE-SC0018249, मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (RGP0015/2017), डो संयुक्त जीनोम संस्थान etop अनुदान के विभाग, और शिकागो सामुदायिक ट्रस्ट में समर्थन के लिए searle कोष से समर्थन के साथ शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम ।

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
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Citer Cet Article
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
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