ウイルス融合ペプチドの胸の谷間のサイトを表すペプチドのプロテアーゼのプロテアーゼ活性の迅速なスクリーニングを可能にする蛍光ペプチド胸の谷間の試金を提案します。このメソッドは、プロテアーゼ活性をテストする蛋白質シーケンス内で他のアミノ酸モチーフにも使用できます。
コロナやインフルエンザ ウイルスなどエンベロープ ウイルスでは、宿主細胞に感染することができるため、融合蛋白質の蛋白質分解開裂を必要があります。多くの場合ウイルスは、細胞・組織親和性を展示し、特定の細胞や組織のプロテアーゼに適応しています。さらに、これらのウイルスは、胸の谷間に影響を与える可能性がありますし、新しいホストへの適応に貢献することができますレプリケーション中に突然変異または彼らのゲノムへの挿入を導入できます。ペプチド模倣ウイルス融合蛋白質の胸の谷間のサイトの迅速なスクリーニングを可能にする蛍光ペプチド胸の谷間の試金を紹介します。テクニックは非常に柔軟で、多くの異なる基板上に単一プロテアーゼのプロテアーゼ活性を調査する使用ことができます、さらに、ことも 1 つまたは複数のペプチド基板上に複数のプロテアーゼの活動の探査ができます。本研究では、コロナ ウイルス スパイク ・ プロテインの胸の谷間サイト モチーフを模倣したペプチドを使用しました。我々 は人間テストし、ラクダ派生中東呼吸器症候群コロナ (MERS CoV) 胸の谷間サイトのシングルとダブルの代用できる風鈴の活動を変えるし、開裂の効率を劇的に変えることを示す。バイオインフォマティクスとの組み合わせで、異なる血清型菌株から猫コロナ ウイルス スパイク蛋白質の風鈴胸の谷間アクティビティをテストするのにはこのメソッドを用いても。このペプチド ベースの方法はより少ない労働と時間のウイルスのプロテアーゼ活性の分析に使用する従来の方法よりも集中的な 1 日で結果が得られます。
宿主細胞膜とウイルスの融合の囲まれたウイルスのライフ サイクルの重要なステップは、細胞やウイルスの増殖への参入を容易に.通常、ウイルスは宿主細胞膜上の受容体に結合し、ウイルス細胞膜融合1をトリガーする専門にされた蛋白質 (または蛋白質) を所有しています。ウイルスの融合蛋白質は、3 つの主要なクラス (I-iii)1に分類されています。インフルエンザ (鳥から長年獣出現を表す) および中東呼吸器症候群コロナ ウイルス (MERS コロナ ウイルス) などの公衆衛生のための主要な関心事は、現在ウイルスの数 (最近を表す人獣共通感染ラクダから出現)、いわゆる利用クラス I の融合蛋白質の膜融合活動2を発揮する、ホストのプロテアーゼによって蛋白質分解処理を必要とします。同様に、猫コロナ ウイルス (FCoV)、野生および国内猫のための主要な疾患の脅威を表し、またクラスを所有している私の融合タンパク質。クラス I 蛋白質通常分解されていないの前駆体として合成され、受容体結合とそれぞれ融合イベントのトリガーは、2 つのドメインから成っている一般にウイルスの融合。日に、インフルエンザ ヘマグルチニン (HA) は最高の融合蛋白質の理解し、多くの研究は、ホスト セルのエントリと融合3におけるその機構の役割を説明しています。この場合融合タンパク質の胸の谷間は、特定の順序または胸の谷間サイト HA、内および pH 依存性構造変化、ウイルス融合ペプチド1,2の露出の結果との併用で発生します。
融合ペプチドおよびその前のプロテアーゼ認識シーケンス病原性とウイルスの宿主適応のため重要です。プロテアーゼ認識シーケンスの変更は、大幅にウイルスのホスト4潜在的劇的な結果と胸の谷間を変更できます。一方で、胸の谷間を廃止し、ウイルスのライフ サイクルを排除することできます。しかし、その一方で、突然変異を特定プロテアーゼの基質特異性を増加したり、融合タンパク質を切断する「新しい」プロテアーゼを許可します。その後、これまた観察、例えば、インフルエンザ ウイルスのサブタイプ5,6細胞・組織親和性を拡張できます。通常低病原性鳥インフルエンザ (LPAI) ウイルスとほとんどの人間のインフルエンザ ウイルスは、それらをアクティブにするプロテアーゼの限定のローカリゼーションのため消化管や呼吸器管に限られています。通常、このような HA 蛋白質の膜融合ペプチド トリプシン様セリンプロテアーゼ トリプシン、matriptase または TMPRSS27,のように認識されているとは 1-2 非連続した塩基性アミノ酸で構成されています 4 アミノの酸シーケンス付加されて8します。 挿入または胸の谷間サイト多サイトに変更突然変異ウイルスを取得するとことができます風鈴 HA をアクティブにし、はるかに深刻な全身感染6,9を引き起こす可能性があります。これらのウイルスは、高病原性鳥インフルエンザ (HPAI)、h5n1 型株に代表されると呼ばれます。
インフルエンザ HA と対照をなして MERS コロナ ウイルスなど多くのコロナのスパイク蛋白質内の 2 つの明瞭な胸の谷間サイトがあります。S1/S2 サイト S2 と呼ばれる 2 番目の胸の谷間サイト C 末端融合領域 (S2) から N 末端受容体結合ドメイン (S1) で区切る ‘ 融合ペプチド10への近さで、S1/S2 サイトの下位。サイトが S1/S2 S2 の順で、順番に切断されることが示唆された」。ほとんどのインフルエンザ ウイルス、MERS コロナ ウイルス S タンパク質 S1/S2、S2 の HA と対照をなして ‘ サイトをするプロタンパク質転換 (PC) 家族、風鈴などのプロテアーゼによって認識できます。この家族のメンバーは、モチーフ R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2塩基性残基ペアで切断します。一般に、胸の谷間のサイトの上流アミノ酸はP1、P2、P3 などと呼ばれます。P1 に指定されている胸の谷間サイトとアミノ酸を下流から数えて ‘、P2’、P3’、等。11. FCoV 系統が単一またはデュアル胸の谷間サイトありますか。MERS コロナ ウイルスのようないくつかの FCoV 系統は、胸の谷間の 2 つのサイトをまた所有している (S1/S2 と S2′) の S 蛋白質。しかし、この特徴は血清型を除く私の FCoVs (A クレードです)。対照的に、血清型 II (クレード B) グループのメンバーにのみシングル胸の谷間サイトがあります (S2′)2,12。いくつかのプロテアーゼは、風鈴、トリプシン様プロテアーゼ カテプシンなど、月間 FCoV 胸の谷間サイトを切断して提案されています。それが、(として知られているネコ腸コロナ ウイルスまたは FECV) 腸の FCoV の S タンパク質が S1/S2 サイトの風鈴とこのサイトの突然変異によって裂かれる可能性が提案されている (同様 S2′) プロテアーゼの要件の変更に 。これらの突然変異は親和性とウイルスが全身になるとマクロファージ トロピック (として知られているネコ伝染性腹膜炎ウイルスまたは FIPV)13、これらのウイルスの病原性の変化に関連付けられています。
ウイルスは当然各レプリケーション サイクル中に彼らのゲノムに突然変異を導入、頻繁に新しいサブタイプとインフルエンザ、MERS コロナ ウイルスと FCoV は説明14,,1516です。、新興ウイルスの公衆衛生上の脅威を評価するために迅速な評価の一環として、胸の谷間のサイトとどのようにこれらのウイルスを活性化プロテアーゼの範囲に影響を与える変更を調査するため重要です。ここでは、与えられたプロテアーゼと急速に画面のプロテアーゼ切断する機能のために基質特異性に影響を与える MERS コロナ ウイルス S タンパク質の胸の谷間のサイトの変更を非常に迅速に評価ができるペプチド ベースのアッセイについて述べる、与えられたまたは複数シーケンス4。実験の第二セットで、血清型 FCoV 別や系統風鈴切断活性を決定する手法を使いました。
この試金で使用されるペプチドは、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) ペア 7-メトキシクマリン-4-イル アセチル (MCA) N-2, 4-ジニトロフェニルアミン (DNP) C 末端と N 末端で変更されます。アッセイ中に MCA は、興奮して、ペアが互いに近くにある限り、DNP による焼入れは光のエネルギーを放出します。胸の谷間が発生した場合ただし、DNP はもう放出を抑制することができるないと蛍光プレート リーダーで読み取ることができます。ペプチド切断率を決定して、プロテアーゼ切断特異的ペプチド (として知られている Vmax)17速度を計算する実験中に蛍光の変化を測定します。
ペプチドを設計するためにそれぞれの融合蛋白質の遺伝子必要がありますシーケンスまたはされたデータベースで利用可能します。ただし、メソッドは、少ない労働強い、通常、胸の谷間を分析する哺乳類セルで表現する発現ベクターへの融合蛋白質遺伝子のクローニングを必要とする従来の方法よりも高価です。最初から最後まで、ペプチド、プロテアーゼがあり、すぐに 1 日の内でここに示すペプチド アッセイを行うことができます数週間まで数日かかることがありますこの。アッセイのセットアップは、サンプル数に応じて 5 〜 30 分間と蛍光プレート リーダーでランタイムは 1 時間データの分析は、サンプル サイズによって再び 2 h までをかかることがあります。
ここでは、分析を提示する 2 つの異なる例を選びました。最初の例では、我々 は人間の種の壁を越える場合にアクティブ化されるラクダの派生系統の潜在性を評価するために、人間とラクダ派生 MERS-コロナ ウイルスの風鈴を介した胸の谷間を比較データを提示します。2 番目の例では、S1/S2 と S2 の風鈴を介した胸の谷間を決定する蛍光ペプチド アッセイを使用 ‘ のサイトまたは S2’ 2 つのサイト私は、2 つの血清型 II FCoV 株をそれぞれ血清型します。これらの実験は肯定的な制御としてトリプシン分裂を使用しました。
プロテアーゼの蛋白質分解開裂のタンパク質配列の高速スクリーニングにより蛍光ペプチド アッセイをご紹介します。最初の例では異なる胸の谷間を選んだが、サイトこの試金のための 1 つのアプリケーションを説明するために MERS コロナ ウイルス スパイク (S) 蛋白質のモチーフ。いくつか種を横断する可能性があります私は MERS コロナ ウイルス、Sars-cov (重症急性呼吸器症候群)、インフルエンザなどのタンパク質は、公衆衛生のための主要な懸念と新しいサブタイプを進化を続けるフュージョン クラスを所有しているウイルスに包まれて人間1,15,16に彼らの自然なホストからの障壁。実験室でそれらを栽培し、ウイルスを分離できない可能性があります常にまたは研究のすべての施設では利用できない特別な実験室が必要です。したがって、通常の実験室の条件の下で行うことができる新たなウイルスの潜在的な公衆衛生の脅威を評価する手法の必要性があります。ウイルスに加え人間のターゲット、FCoV のようないくつかの動物のウイルスも持っている同じクラス I の融合蛋白質、したがって、彼らの人間の同等よりも同様の特性を共有します。これらのウイルスを分離することに、挑戦、必要なそれらを勉強する革新的なツールの活用も可能です。
上記のウイルスのライフ サイクルの重要なステップは、セルに入力するホストとホスト プロテアーゼ1,2でそれぞれ融合タンパク質のプロテアーゼによるプロセシングを介した融合です。融合タンパク質の遺伝子を哺乳類発現ベクターにクローン、哺乳類細胞タンパク質発現を可能にする、孵化させなさいまたは共同関心、分離のプロテアーゼ transfect transfect にウイルスのライフ サイクルのこの部分を調査する標準的な方法は、タンパク質、西部のしみの分析を実行します。このメソッドは、いくつかの制限が付属しています: 融合タンパク質とその胸の谷間製品を検出する抗体の可用性は、いくつか取ることができる DNA ・ RNA クローニング、DNA または RNA が利用できない場合、遺伝子を合成するためのコストのための可用性週全体の研究が行われるまで。それより多くの時間がかかり、お金と労働集約的なサイト指示された突然変異誘発が必要なために、胸の谷間のサイトでいくつかの変異を調査する場合は、研究の関心をもなります。ここで述べる蛍光ペプチド アッセイでは、これらの制限はありません。興味のペプチドは、公に利用可能なシーケンスに基づくような研究のこれらの種類に関連する組換えのプロテアーゼの広い範囲を提供するいくつかの製造者がある、内分析を含むアッセイを行うことが、1 日。
S2 の風鈴を介した胸の谷間を調べた例では、’ 人間とエジプトとモロッコからラクダに由来する MERS コロナ ウイルス S タンパク質のプロテアーゼ認識サイト。人間の EMC/2012 とラクダ HKU205 S2′ サイトに典型的な RXXR 風鈴胸の谷間モチーフが含まれています。しかし、スコアリング アルゴリズム HKU205 S2 ピトー 2.0 胸の谷間によると ‘ サイトは実験的確認19風鈴、我々 によって裂かれると予測されていません。理由なぜ HKU5 S2′ によっては処理されません風鈴は P1 のイソロイシンが原因かもしれない ‘ の位置。EMC/2012 S2 で個々 の変異を運ばれる 2 つのペプチドでテストしたとき ‘シーケンス、我々 がすることを確認できた、P1 のイソロイシン’ 主置換セリンをアラニンは、減らされた胸の谷間が胸の谷間を放棄します。Mor213 S2′ 風鈴胸の谷間モチーフがサイトに含まれていないと、ほとんどない胸の谷間を検出する驚きではありません。S1/S2 と S2 の風鈴の切断、また調べた ‘ FCoV S タンパク質のプロテアーゼ認識サイト。両方 FECV ペプチドの風鈴胸の谷間を観察することができました (FECV I と 4 S1/S2 と FECV II 1683 S2’)、FIPV ウイルス変異塩基配列された風鈴は切断しません。
風鈴を介した EMC/2012 S2 の胸の谷間を比較するとき ‘ FECV I と 4 S1/2 ペプチド (図 2 a) ペプチド (図 1 a)、私たちは、Vmax でおおよそ 26-fold 違いがあったことが分かった。これは、両方のシーケンス (表 1) に風鈴胸の谷間モチーフによって説明することができます。風鈴胸の谷間の最小要件は RXXR モチーフが、RXRR シーケンスははるかに有利な2です。したがって、EMC/2012 S2′ RSRR 風鈴胸の谷間サイト (表 1) を含む FECV I と 4 S1/2 ペプチドと比較して少ない特異性の RSAR モチーフであるペプチドを切断します。
しかし、アッセイの 1 つの主要な制限は、ペプチドは、彼らは通常に埋め込まれているタンパク質の三次構造を反映していません。完全な長さの融合蛋白質の胸の谷間公開融合ペプチドとトリガー ホスト セルのエントリ1。プロテアーゼとの融合タンパク質間の相互作用も影響を受ける可能性融合タンパク質の三次構造で中のペプチドがもっとまたはより少なく線形場合を考えます。したがって、ペプチド アッセイの検出された胸の谷間は人工があり、体内の状況を反映していない可能性があります。これはインフルエンザ H3N2 HA サブタイプの胸の谷間の matriptase によって報告されました。いくつかのグループは、ペプチド アッセイの matriptase によって H3N2 HA の開裂を説明、また全長 H3N2 HA 蛋白質および細胞培養の matriptase の孵化でした融合性 HA 蛋白質4,20、発生しないことが示されました。 21。蛋白質分解開裂の生物学的に重要な規制がタンパク質の立体構造のレベルであることを示すその他の例があります。それは、融合蛋白質は時々 一連の融合時に胸の谷間サイトを公開できるように事前の融合イベントを必要があることが記載されています。セムリキ森林ウイルス融合タンパク質、たとえば、その融合タンパク質を公開し、プロテアーゼ活性化22の使用できるようにするために prefusion イベントの数の間に構造再配列が必要です。したがって、蛍光ペプチド分析で得られた結果は、細胞融合の試金または同様の実験によって検証する必要があります。ただし、ペプチド アッセイには、いくつかのプロテアーゼ/ペプチドの組み合わせと胸の谷間を表示しない組み合わせが生体内で同じ結果が発生する可能性が高いので、労力とフォロー アップの実験の時間を減らすために高速スクリーニングができます。
アッセイの 2 番目の主要な制限は、プロテアーゼを懸念します。これまでのところ溶性プロテアーゼですがない膜プロテアーゼをテストすることが可能です。に応じて、実験の意図、これ問題になることができます。たとえば、インフルエンザが8細胞膜にある膜プロテアーゼの数によってアクティブ化されます。ある程度、可溶性蛋白分解アクティブなドメインを使用してこの問題を回避ことができますが、結果は慎重に解釈しなければならないし、従来の方法で検証する必要があります。我々 は matriptase と h3n2 型 HA に向けて活動 beforementioned の例を参照してくださいしたいと思います。Matriptase生体内では細胞膜にあるが、市販の酵素は水溶性の触媒ドメイン。融合蛋白質に関して議論、胸の谷間と単一ドメインのみをテストの偽陽性の結果可能性があります取得する実物大蛋白質基板との対話をフルレングスのプロテアーゼがまた必要です可能な場合があります。
この方法論は、風鈴による特定のアミノ酸シーケンスの胸の谷間に効率的であると示しています。ただし、任意の利用可能なプロテアーゼ (例えばカテプシン、するプロタンパク質転換) する技術範囲のアプリケーション画面ペプチド候補者プロテアーゼ切断のために役に立つメソッドにすること。さらに、それは、この試金がプロテアーゼ阻害剤の有効性をテストするためにも使用できます、したがって、高速かつ簡単にするツール画面タンパク質阻害剤23を提供して示されています。
ここで説明した蛍光ペプチド胸の谷間アッセイは、アミノ酸のプロパティとシーケンスに基づいて断固としたプロテアーゼによってペプチド胸の谷間を予測するスコアリング アルゴリズム、バイオ情報谷間に加えを表します。ウェスタンブロッティング技術の伝統との組み合わせで、これらの 2 つの手法は、プロテアーゼの胸の谷間で培養を研究する効率的な方法として使用できます。
The authors have nothing to disclose.
本稿で提示する MERS プロジェクトは、NIH によって提供された研究の資金は、R21 AI111085 付与します。猫コロナ ウイルスの研究は、モリス動物財団、ウィン ネコ科の基礎、コーネル猫健康センターからの研究補助金によって支えられました。我々 はまたマリク ピーリス提供いただきありがとうございます私たち Mor213 シーケンスを持つそれは公開前にしたいと思います。
Peptides | Biomatik | N/A | |
Furin | NEB | P8077S | |
Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Prism 7 | GraphPad | N/A |