Мы представляем assay расщепления fluorogenic пептид, который позволяет быстрое скрининг протеолитической активности протеаз пептиды, представляющий сайт расщепления пептидов вирусных фьюжн. Этот метод также может использоваться на любой другой мотив аминокислоты в последовательности белка для проверки активности протеаз.
Оболочечных вирусов, таких как коронавирус или гриппа вирус требуют протеолитического расщепления их синтез белка, чтобы иметь возможность заразить клетки-хозяина. Часто вирусы экспонат клеток и тканей тропизма и адаптированы к конкретным клетки или ткани протеаз. Кроме того эти вирусы могут ввести мутации или вставки в их геном во время репликации, что может повлиять на раскол и таким образом могут способствовать адаптации к новому хозяину. Здесь мы представляем assay расщепления пептидов fluorogenic, который позволяет быстрое скрининг пептидов, подражая сайт расщепления белков вирусной фьюжн. Методика является очень гибкой и может использоваться для изучения протеолитической активности одного протеазы на многих различных субстратах, и Кроме того, он также позволяет исследовать деятельности нескольких протеаз на один или несколько пептидных субстратов. В этом исследовании мы использовали пептиды, подражая мотивы сайте расщепления белка Спайк коронавирус. Мы протестировали человека и верблюд производных коронавирус Ближнего Востока респираторный синдром (РВК-CoV) продемонстрировать что одноместные и двухместные замен на сайте расщепления может изменять активность Фурин и резко изменить эффективность расщепления. Мы также использовали этот метод в сочетании с биоинформатики для проверки активности расщепления Фурин кошачьих коронавирус Спайк белков из различных серотипов и штаммов. Этот метод на основе пептида меньше труда и времени интенсивные, чем традиционные методы, используемые для анализа протеолитической активности вирусов, и результаты могут быть получены в течение одного дня.
Вирусная сплавливание с принимающей клеточной мембраны представляет собой решающий шаг в жизненном цикле оболочечных вирусов и облегчает проникновение в клетки и репликации вируса. Как правило вирусы обладают специализированными белок (или белки), которые связывается с рецепторами на хост клеточной мембраны и вызывает вирус клеточной мембраны фьюжн1. Вирусных синтез белков, были сгруппированы в три основные классы (I-III)1. Количество вирусов, которые в настоящее время являются серьезной проблемой для общественного здравоохранения, таких, как вирус гриппа (представляющий давно зоонозные эмерджентность от птиц) и Ближнего Востока респираторных синдром коронавирус (РВК-CoV) (представляющий недавно зоонозные появление из верблюдов), используют так называемый класс I синтез белков, которые требуют протеолитических обработки узла протеаз, приложить их fusogenic деятельности2. Аналогичным образом, кошачий коронавирус (FCoV), которая представляет собой угрозу основных болезней для диких и домашних кошек, также обладают класса я синтез белка. Класс I вирусных синтез белков синтезируются обычно как прекурсор uncleaved и обычно состоят из двух доменов, которые отвечают за рецептор привязки и вызывает событие фьюжн соответственно. На сегодняшний день, гриппа гемагглютинина (HA) является лучшее понимание синтез белка и многочисленные исследования описал свою механистический роль принимающей ячейки вход и фьюжн3. В этом случае расщепления белка слияние происходит в определенной последовательности или расщепление сайта в пределах га и в сочетании с рН зависимых конформационные изменения, результаты воздействия вирусных синтеза пептида1,2.
Синтез пептида и его предыдущей последовательности признание протеаз являются критическими для патогенности и принимающей адаптации вируса. Изменения в порядке признания протеазы могут изменить расщепления значительно с потенциально драматические последствия для вирус и разместить4. С одной стороны он может отменить расщепления и таким образом устранить жизненный цикл вируса. Но с другой стороны, мутация может увеличить субстратная специфичность для данного протеазы и/или позволяют «новых» протеазы расщеплять синтез белка. Впоследствии это также может расширить тропизм клеток и тканей, как, например, с гриппом вируса подтипов5,6. Обычно низкой патогенности вирусов птичьего гриппа (LPAI) и большинство человеческих вирусов гриппа приурочены к желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей из-за ограниченной локализации протеаз, которые активировать их. Как правило синтез пептида таких белков HA предшествует четыре амино кислоты последовательность, состоящую из 1-2-непоследовательных основных аминокислот, который признан трипсина как сериновые протеазы как трипсина, matriptase или TMPRSS27, 8. когда вирус получает вставки или мутации, которые изменяют сайт расщепления многоосновных сайт, он позволяет Фурин активировать HA и потенциально привести к гораздо более тяжелые системные инфекции6,9. Эти вирусы называются высокой патогенности вируса птичьего гриппа (HPAI), характерна штаммы H5N1.
В отличие от гриппа ха многие коронавирус, например РВК-CoV, имеют два отдельных расщепления сайтов в пределах их Спайк белка. S1/S2 сайт домена фьюжн C-терминал (S2), отделяет N-концевой домен рецептор привязки (S1) с второй сайт расщепления, называется S2′, вниз по течению от сайта S1/S2, в близости к синтез пептида10. Было высказано мнение о том, что сайты являются последовательно, расщепляется на следуют S2 S1/S2 ‘. В отличие от HA большинства штаммов вируса гриппа, РВК-CoV S белка S1/S2 и S2’ сайты могут быть признаны протеаз семейства proprotein конвертазы (ПК), как Фурин. Члены этой семьи прилепится в парных основных остатков с мотив R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Как правило аминокислоты вверх по течению расщепления сайта называются P1, P2, P3, и т.д. считая от расщепления сайта и аминокислоты вниз по течению обозначены как P1′, P2′, P3′, и т.д. 11. FCoV штаммы могут иметь либо одно- или двойной расщепления сайта. Как РВК-CoV, некоторые штаммы FCoV также обладают два расщепления сайтов (S1/S2 и S2′) в их белка S. Однако эта характеристика не включает серотип я FCoVs (клады A). В отличие от этого, члены группы II (клады B) серотип только у одного расщепления сайт (S2′)2,12. Несколько протеаз было предложено прилепится FCoV расщепление сайтов, включая Фурин, трипсин как протеаз и катепсина. Было предложено, что белок S кишечных FCoV (также известен как кошачий кишечных коронавирус или FECV), скорее всего, расщепляется, Фурин на сайте S1/S2 и мутации в этом сайте (а также в S2′) приводит к изменениям в требованиях протеазы. Эти мутации были связаны с изменениями в тропизма и патогенности этих вирусов, позволяя вирус стать системной и Макрофаг Тропик (также известный как кошачий инфекционный перитонит вирусов или FIPV)13.
Вирусы естественно ввести мутации в их геном во время каждого цикла репликации и часто новые подтипы и штаммов гриппа, РВК-CoV и FCoV описаны14,,1516. Будучи частью быстрой оценки для оценки общественного здравоохранения угрозы новых вирусов критически важно для изучения изменений в расщепления сайта и как она влияет на спектр протеаз, активация этих вирусов. Здесь мы описываем пептидной основе assay, который позволяет очень быстро оценить влияние изменения сайта расщепления белка S РВК-CoV субстратная специфичность данного протеазы и быстро экран различные протеаз за их способность расщеплять заданной или множественные последовательности4. Во втором наборе экспериментов мы использовали технику для определения активности расщепления Фурин через различные серотипы FCoV и штаммов.
Пептиды, используемые в этот assay изменяются с парой энергии флуоресценции резонанс передачи (лад), 7-methoxycoumarin-4-yl ацетил (MCA) на окончание N и N-2,4-dinitrophenyl (DNP) в C-terminus. В ходе анализа MCA взволнован и излучает световую энергию, которая является закаленном ДНП, до тех пор, как пара находится в непосредственной близости друг к другу. Если происходит расщепление, однако, DNP не способна утолить выбросов больше и он может быть прочитан флуоресценции пластины читателя. Изменения в флуоресцировании измеряется в ходе эксперимента для определения скорости расщепления пептидов и чтобы рассчитать скорость, с которой протеазы расщепляет конкретных пептида (также известный как Vmax)17.
В целях разработки пептидов, ген соответствующих синтез белка должны были виртуализации или доступны в базе данных. Однако этот метод менее интенсивный труд и дорогостоящим, чем обычные методы, которые обычно требуют клонирования синтеза белка гена в векторы выражения выразить его в mammalian клетках для анализа расщепления. От начала до конца это может занять несколько дней до нескольких недель, в то время как пептид анализов, представленные здесь может быть сделано в течение одного дня, как только пептидов и протеаз доступны. Настройка assay занимает от 5 до 30 мин в зависимости от количество выборок и выполнения в reader пластины флуоресценции что 1 ч. анализ данных может занять до 2 ч снова в зависимости от размера выборки.
Здесь мы выбрали два различных примеров представить assay. В первом примере мы представляем данные, сравнивает Фурин опосредованной расщепление человеческого и верблюд производные РВК-CoV, чтобы оценить потенциал верблюд производные штаммов активируемая в организме человека, если они пересекают видовой барьер. Во втором примере, мы использовали пробирного пептидные fluorogenic для определения Фурин опосредованной расщепления S1/S2 и S2′ сайты или S2′ сайт двух serotype я и два серотип II FCoV штаммов, соответственно. Для этих экспериментов мы использовали трипсина расщепления как позитивный элемент управления.
Мы представляем здесь assay fluorogenic пептид, который позволяет для быстрого скрининга белковых последовательностей для их протеолитического расщепления протеаз. В нашем первом примере мы выбрали разные расщепления сайта мотивы протеина Спайк (S) РВК-CoV чтобы проиллюстрировать одну заявку на этот assay. Несколько оболочечных вирусов, которые обладают класса я синтез белков, таких как РВК-CoV, гриппа и ОРВИ-CoV (тяжелый острый респираторный синдром) являются основными проблемами для здоровья населения и новые подтипы постоянно развиваются, имеют потенциал для кросс видов барьеры из их естественной хостов для людей1,,1516. Изоляция вирусов и выращивание их в лаборатории не всегда возможно или требует специальных лабораторий, которые не доступны в каждом объекте исследования. Следовательно существует необходимость для оценки потенциальной угрозы общественного здравоохранения новых вирусов, которые могут проводиться в условиях регулярных лабораторных методов. Помимо вирусов ориентации людей, некоторые животные вирусы как FCoV также обладают же сорта синтеза белков, таким образом, аналогичными признаками, чем их коллеги-человека. Изолировать эти вирусы также может быть сложной задачей, что делает использование инновационных средств для их изучения необходимых.
Решающим шагом в жизненном цикле вышеуказанных вирусов является запись хоста клеток и синтез протеолитических обработка соответствующих синтез белка при посредничестве принимающей протеаз1,2. Стандартный способ для изучения этой части вирусный жизненного цикла является transfect mammalian клеток, которые позволяют для выражения протеина, инкубировать или совместно transfect с протеазы интерес, изолировать, чтобы клонировать синтеза белка гена в mammalian выражение вектор белка и выполнять Западный анализ помаркой. Этот метод поставляется с некоторыми ограничениями: наличие вирусной ДНК/РНК для клонирования, расходы для синтеза гена, если не ДНК или РНК, наличие антител для обнаружения синтез белка и его продуктов расщепления и это может занять несколько недель до тех пор, пока выполняется всего исследования. Он даже становится больше времени, деньги и трудоемким, если интерес исследования расследовать некоторые мутации на сайте расщепления, потому что он требует сайт Направленный мутагенез. Пробирного пептидные fluorogenic, которую мы опишем здесь не имеют эти ограничения. Пептиды интерес может быть разработан на основе публично доступных последовательностей, есть несколько поставщиков, которые предоставляют широкий спектр рекомбинантных протеаз, которые актуальны для этих видов исследований и анализа, включая анализ может быть выполнена в рамках один день.
В нашем примере, мы рассмотрели Фурин опосредованной расщепление S2′ протеазы признание сайт белка S РВК-CoV, полученных от людей и верблюдов из Египта и Марокко. Как человека EMC/2012, так и верблюд HKU205 S2′ сайты содержат типичный RXXR Фурин расщепления мотив. Однако, по мнению расщепления PiTou 2.0, забив алгоритм HKU205 S2′ сайт не предсказал, чтобы быть расщепляется, Фурин, который мы экспериментально подтверждено19. Причина почему HKU5 S2′ не обрабатывается Фурин может быть обусловлено изолейцина в P1′ позиции. Когда мы проверили два пептидов, которые отдельные мутации в EMC/2012 S2′ последовательности, мы были в состоянии подтвердить, что изолейцин в P1′ основном аннулирует расщепления, тогда как аланина Серина замещения привели к сокращению расщепления. Mor213 S2′ сайт не содержит Фурин расщепления мотив и это было не удивительно обнаружить почти не расщепления. Мы также рассмотрели, как Фурин расщепляет S1 S2 и S2′ протеазы признание сайты белка FCoV S. Мы были в состоянии соблюдать Фурин расщепления пептидов как FECV (FECV I и-4 S1/S2 и FECV II 1683 S2′), в то время как мутировал последовательности от FIPV вирусов были не расщепляется, Фурин.
При сравнении Фурин опосредованной расщепление EMC/2012 S2′ пептида (рис. 1A) с пептидами FECV I и-4 S1/2 (рисунок 2A), мы обнаружили, что существует приблизительно эмиссия разница в Vmax. Это можно объяснить мотив Фурин расщепления в обеих последовательностях (Таблица 1). В то время как минимальное требование для расщепления Фурин RXXR мотив, RXRR последовательность является гораздо более благоприятной2. Таким образом, EMC/2012 S2′ пептид, который имеет RSAR мотив, расщепляется с менее специфика, по сравнению с пептидной FECV I и-4 S1/2, который содержит сайт расщепление RSRR Фурин (Таблица 1).
Однако одним из основных ограничений assay является, что пептиды не отражают третичную структуру протеина, которую они обычно встроены в. Расщепление полная длина синтез белка предоставляет синтеза пептида и триггеры принимающей ячейки ввода1. Взаимодействие между протеазы и синтез белка могут быть затронуты также Третичная структура синтез белка, в то время как мы предполагаем, что пептиды являются более или менее линейной. Следовательно расщепление, обнаруженных в assay пептида возможно, искусственной и могут не отражать ситуацию в естественных условиях . Об этом сообщила для расщепления гриппа H3N2 га подтип matriptase. Хотя несколько групп описанный расщепления H3N2 га matriptase в пептидной анализов, также было показано, что инкубации полная длина H3N2 га протеина и matriptase в клеточной культуре не привели к fusogenic HA белка4,20, 21. Существуют другие примеры, которые показывают, что биологически важные регулирование протеолитического расщепления находится на уровне конформации белка. Он был описан синтез белков иногда нужно серии предварительно фьюжн событий, чтобы иметь возможность подвергать расщепления сайтов после слияния. Семлики лес вирус синтез белка, например, требует структурных перестроек во время prefusion событий для того, чтобы разоблачить его синтез белка и сделать его доступным для активации протеолитических22. Таким образом результаты, полученные в assay пептидные fluorogenic должны быть одобрены клеток фьюжн анализов или подобные эксперименты. Однако пептид assay по-прежнему позволяет быстрый показ нескольких комбинаций протеазы/пептида и сократить труда и время последующих экспериментов, поскольку комбинации, которые не показывают расщепления весьма вероятно выставлять же результат в естественных условиях.
Вторым крупным ограничение assay касается протеаз. Пока это возможно только для тестирования растворимых протеаз, но не трансмембранного протеаз. В зависимости от замысла эксперимент это может быть проблемой. К примеру гриппа HAs активируются ряда трансмембранного протеаз, расположенный в клеточных мембранах8. В определенной степени эту проблему можно обойти, используя растворимых протеолитических активных доменов, но результаты должны интерпретироваться с осторожностью и должны быть проверены с обычными методами. Мы хотим сослаться на пример beforementioned с matriptase и его деятельности в направлении H3N2 га. В естественных условиях matriptase расположен в клеточной мембраны, но коммерчески доступных фермент — растворимые каталитического домен. Как уже говорилось в отношении синтез белков, возможно, что она также требует полнометражного протеазы взаимодействовать с полнометражного белкового субстрата для получения расщепления и что тестирование только отдельные домены может привести ложных срабатываний.
Эта методология показал, чтобы быть эффективным для изучения расщепления определенных аминокислотных последовательностей, Фурин. Однако применения техники экстентов в любых доступных протеазы (например, катепсинов, proprotein конвертазы), что делает его полезным методом для экрана пептид кандидатов для расщепления протеазы. Кроме того было показано, что этот assay может также использоваться для проверки эффективности ингибиторов протеазы и таким образом обеспечивает быстрый и простой инструмент для экрана белковых ингибиторов23.
Fluorogenic пептид расщепления assay описанных здесь представляет собой дополнение к bioinformatic расщепления, алгоритмы, который предсказывает расщепления пептидов определяется протеазы, на основе свойств аминокислоты и последовательности. Эти две методики, в сочетании с традицией западной blotting методы может использоваться как эффективный метод для изучения протеазы расщепления в пробирке.
The authors have nothing to disclose.
Финансирование исследований для РВК проект, представленный в этой рукописи была предоставлена NIH Грант R21 AI111085. Кошачий коронавирус исследование было поддержано научно-исследовательских грантов от Моррис животных Фонд, Уинн кошачьих фонда и центр здоровья кошачьих Корнелл. Мы также хотели бы поблагодарить Малик Пейрис за предоставленную нам с Mor213 последовательность, прежде чем он был общедоступным.
Peptides | Biomatik | N/A | |
Furin | NEB | P8077S | |
Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Prism 7 | GraphPad | N/A |